进展期胃癌新辅助化疗疗效预测因子的临床研究

在我国，胃癌仍为最常见的恶性肿瘤之一，约2/3患者就诊时已为中晚期’目前研究已i}l.实，进展期胃癌新辅助化疗可使肿瘤缩小、临床分期降低，从而提高胃癌的根治性切除率、减少术后复发转移。由于患者对不同化疗方案的敏感性不同，寻找可靠的化疗敏感性预测指标;旱期筛选出对化疗应答不敏感的患者.减少不必要的术前化疗，成为临床重要课题之一.针对于此，我们对进展期胃癌进行多基因免疫组化检测，从中筛选出可能对mFOLFOX7方案新辅助化疗敏感的预测因子，为胃癌的个体化治疗提供重要的依据.　　资料与方法　　一、临床资料　　人组标准:(1)胃镜下活检确诊为胃癌;(2)术前分期且期以上的患者;(3)年龄大于18岁且小于70岁，并且katnofsky评分大于或等于70;(4)无化疗和手术禁忌;(5)无其他的恶性疾病，既往无胃部手术史;(6)化疗患者均签署知情同意书按上述标准选取2009年8月至2011年8月潍坊市人民医院肿瘤外科收治的53例术前病理学确诊的进展期胃癌患者，所有病例之前均未接受过任何治疗。其中男40例，女13例)年龄3369中位年龄59)岁二病变部位:胃窦部20例，胃体部16例，胃食管结合部17例。病理类型:中、低分化腺癌38例，印戒细胞癌9例，粼液腺癌及其他6例、初步临床分期:Il期19例，l期34例术前评价包括胸片，全腹平扫加强化双源螺旋CT检查，必要时扫描盆腔及胸腔，腹部超声，心电图，生化全项，全血细胞计数，肿瘤标志物等部分患者行超声胃镜(资料不全).　　二、治疗方法　　对所有人选患者行mFOLF'OX7双周方案化疗:奥沙利铂(L-OHP)100mg/m'-静脉滴注2h，第1天;亚叶酸钙(CF)400m}/m`静脉滴注2h.第1天;氟尿嚓咤(5-FU)2400mg/m=持续静脉泵人46h2周后重复，共4周期化疗结束后4周行标准胃癌根治手术.　　三、疗效评价标准　　化疗前后以螺旋CT,胃镜及术后病理切片相结合的方法作为疗效判断的证据。新辅助化疗后原发病灶的疗效判定根据RECISTI.1标准评估，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)及疾病进展(PD);有效:PR加CR，无效:SD加PD病理完全缓解(pCR):手术标本中无癌细胞残留病理部分缓解(pPR):有单个或小癌灶残留;疗效小:残留癌灶伴纤维增生;疗效差:疗效微小或无疗效，广泛残余癌细胞。　　四、各基因检测方法及结果判定　　采用免疫组织化学(免疫组化)SP法和荧光原位杂交法(FISH)，所用试剂购自北京中杉金桥生物有限公司和ROCHE诊断产品有限公司。新辅助化疗前胃镜活检获取肿瘤组织，手术后切除标本分别予以检测，检测方法按试剂盒说明书进行。　　C-met蛋白定位于胞质和胞膜，TOPO-II蛋白定位于胞核，阳性细胞均染成黄色或棕黄色颗粒，以阳性细胞所占百分率来表不。阳性细胞数小于25%r为阴性，阳性细胞大于或等于25%为阳性。　　EGFR,HER-2蛋白定位于细胞膜，呈棕褐色，细胞膜未着色或阳性细胞数小于10%为(一)，大于或等于lOclc巨细胞膜不完整染色为(十)，两者均定为阴性。大于或等于10%且细胞膜完整轻至中度染色为(+十)，大于或等于10%且细胞膜完整的强染色为(+++)EGFR表达(++一十++)定为阳性。HER2表达(+++)为阳性，见图1;(++)为不明确，再进行FISH检测，若FISH为(+)则定为阳性，见图2。对于活检标本HER2以成簇的肿瘤细胞膜染色来评估，不管着色细胞百分比若染色为(++)同样进行FISH检测。P53和I}i67阳性染色呈棕黄色颗粒，均定位于细胞核。P53和hi67均以肿瘤细胞不着色或小于10%的肿瘤细胞着色为阴性，大于或等于10%的肿瘤细胞着色为阳性，见图3oMMP-7染色阳性反应为细胞浆中出现淡黄色至棕褐色颗粒。　　根据染色的强度及阳性细胞的面积判断结果。每张切片阳性细胞的染色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别计分为。,1,2,3分;按阳性细胞面积分别计分为0,1(1%}25%),2(26%}50%),3(51%}75%)和4(76%一100%)，据2项打分之积判断结果:0分为阴性，大于或等于1分为阳性。　　五、统计学方法　　采用SPSS16.0统计软件，用才检验、趋势才检验及Lo办stic多因素回归分析处理相关数据。　　结果　　一、新辅助化疗治疗情况及疗效　　本组53例患者全部完成mFOLFOY7方案新辅助化疗，无中途退组者。总有效率为52.8%(28/53其中PR为52.8%(28/53),SD为45.3%(24/53),PD为1.9%(1/53)。不良反应均能耐受化疗结束4周后行胃癌DZ根治术，R。切除者45例，姑自、切除者8例。均无并发症出现。随访至今均生存.　　二、各基因的表达与新辅助化疗疗效的关系　　新辅助化疗前后，各因子的表达差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。新辅助化疗前，HER2阳性表达者化疗有效率为83.3%(10/12)，阴性表达者有效率为43.9%(18/41)，前者明显高于后者(P<0.05);P53阳性表达者化疗有效率为35.7%(10/28)，明显低于阴性表达者的72.0%(18/2s)(P<o.os);C-met,EGFR,Ki-67,MMP7及ToPO}的表达与化疗敏感性无关(P>0.05)。见表2oLogistic多因素回归分析显示，HER2和P53是化疗敏感性独立影响因素(P<0.05)，表3}　　三、HER2和P53与新辅助化疗疗效的关系将HER2与P53的表达情况分为亚组，各亚组新辅助化疗疗效见表4。其中，6例患者HER2阳性，同时P53阴性表达，其新辅助化疗疗效均为有效，明显优于其他亚组患者，差异有统计学意义}X'=11.17，P=0.001)。　　讨论　　随着胃癌新辅助化疗受到越来越多的重视，如何预测胃癌化疗敏感性的问题日渐突出。如果能找到较为准确预测胃癌新辅助化疗敏感性的标志物，将有助于临床医生根据肿瘤的分子生物学特征选择更有效的治疗方案。目前胃癌新辅助化疗方案的临床有效率仍然在40%}50%]Z-'oLi等川报道FOLFOX方案新辅助化疗能显著改善中国人局部进展期胃癌的治疗效果，有效率为64%。本研究中，mFOLF'OX7方案新辅助化疗有效率为52.8%，与报道基本相似。　　日本的临床试验发现，胃癌的辅助化疗可以临床获益〔4-5];而欧美研究的结果并未得出相同结论。说明术后辅助化疗可能存在着耐药现象，同时新辅助化疗中的存在不敏感患者也提示了这个问题。既往研究认为肿瘤的耐药机制主要是由多药耐药所导致，某些耐药基因产物的过度表达会导致耐药增强，对某种或数种化疗药物不敏感，从而导致化疗失败。近年来，临床曾经用此指标来指导化疗，但并没有提高化疗的有效性。因此，我们转换思路，从胃癌的一些生物学相关基因着手研究，探讨胃癌化疗药物的敏感性是否跟胃癌相关基因的表达有内在关系。　　HER2是表皮生长因子受体家族的一员，位于染色体17q21，编码一种分子量为185000的跨膜糖蛋白(P185)。在胃癌中，常见HER2基因扩增和RNA及蛋白质的过度表达，但在所有非胃癌组织中均检测不到，表明HER2蛋白在胃癌的发生、发展和侵袭性转移性上发挥着重要作用。目前对于HER2蛋白在胃癌中过度表达情况争议较大，近期文献报道，胃癌和胃食管结合部癌中HER2蛋白表达率为4%}28%}8}oHER2过表达提示肿瘤细胞增生活跃，理论上应对化疗更敏感，本研究发现，HER2扩增的患者新辅助化疗的有效率明显高于HER2阴性的患者，HER2也是独立的化疗敏感性影响因素。我们推测，是否HER2呈现高表达的肿瘤细胞对抗化疗药物诱导的细胞凋亡作用通过中间某种机制而被抑制，尚待进一步明确。　　许多癌基因和抑癌基因不仅参与了恶性肿瘤形成，亦参与了肿瘤细胞的耐药，在肿瘤的多药耐药中也起着至关重要的作用[9〕。p53基因为肿瘤抑制基因，分为野生型和突变型。突变型p53基因是促癌基因，当该基因发生突变时，对细胞凋亡的调控作用受阻，导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性。我们用免疫组化法检测到的均是突变型p53o本组结果显示，P53表达阳性者新辅助化疗有效率明显低于表达阴性者，并且多因素回归分析显示，P53同样也是独立的化疗敏感性影响因素。目前研究证实，p53和P糖蛋白免疫反应性明显相关，有协同作用〔'0-ap53肿瘤基因可激活MDR1基因，导致MDR1/P-gp表达增加。MDR1基因启动子CAT是P53抑癌基因的靶分子，野生型p53具有抑制MDR基因转录作用，而突变型p53基因能加强MDR基因表达，并通过抗细胞凋亡使肿瘤细胞产生耐药性。我们推测，突变型p53可能通过抑制细胞凋亡和促进MDR基因的激活至少两种途径介人了胃癌耐药的发生。　　本研究通过亚组分析还发现HER2和P53具有协同作用，HER2阳性同时P53阴性表达的胃癌患者新辅助化疗疗效均为有效，明显优于其他亚组患者(P<0.05)。但因HER2与P53共同表达的病例数少，若要得出准确可靠结果尚需大样本研究。研究还发现，其余5个胃癌相关的生物学因子C-met,EGFR,Ki-67,MMP7及TOPOII均与mFOLFOX7新辅助化疗敏感性无关。我们还观察到C-met,EGFR,HER2,Ki-67,MMP7,P53及TOPOIf等生物学因子在新辅助化疗前后肿瘤组织中的表达虽都有不同程度的改变，但差异并无统计学意义，考虑化疗药物对这些因子蛋白的表达无明显影响。　　综上所述，由于本研究病例数有限，且除所选的指标外还可能有其他影响疗效的因素，故还不能断言HER2和P53是胃癌mFOLFOX7新辅助化疗方案最有效的预测指标。但初步可以看出，HER2和P53的表达情况对mFOLFOX7方案新辅助化疗疗效的预测有重要价值，有可能作为该方案的疗效预测指标。　　参考文献　　徐光炜. 胃癌治疗的现状及问题[J].外科理论与实践,2003,(1):3-6.doi:10.3969/j.issn.1007-9610.2003.01.002.　　Ji JF,Yu Z,Zhang XN. Oxanliplant-based regimen as neoadjuvant chemotherapy for Chinese patient with advanced gastric:preliminary result of a phase Ⅱ study[J].Proceedings of the American Society of Clinical Oncology,2004.4184.　　Li ZY,Koh CE,Bu ZD. Neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX:Improved outcomes in Chinese patients with locally advanced gastric cancer[J].Journal of Surgical Oncology,2012.793-799.　　Nakajima T,Kinoshita T,Nashimoto A. Randomized controlled trial of adjuvant uracil-tegafur versus surgery alone for serosa-negative,tocany advanced gastric cancer[J].British Journal of Surgery,2007.1468-1476.　　Sakuramoto S,Sasako M,Yamaguchi T. Adjuvant chemotherapy for gastric cancer with S-l,an oral fluoropyrimidine[J].New England Journal of Medicine,2007.1810-1820.　　Nitti D,Wils J,Dos Santos JG,et a l. Randomized phase Ⅲ trials of adjuvant FAMTX or FEMTX compared with surgery alone in resected gastric cancer.A combined analysis of the EORTC GI Group and the ICCG[J].Annals of Oncology,2006.262-269.　　Cascinu S,Labianca R,Barone C. Adjuvant treatment of high-risk,radically resected gastric cancer patients with 5-fluomuracil,leucovorin,cisplatin and epidoxorubiein in a randomized controlled trial[J].Journal of the National Cancer Institute,2007.601-607.　　Bouché O,Penault-Llorca F. HER2 and gastric cancer:a novel therapeutic target for trastuzumab[J].Bulletin Du Cancer,2010.1429-1440.