人食管鳞癌细胞系EC109中肿瘤干细胞的分离（富集）与鉴定

近年来肿瘤研究的重要进展之一是肿瘤干细胞(CSCs)的发现与特性研究。目前已从多种肿瘤中分离获得CSCs,包括白血病[1]和多种实体瘤如乳腺癌[2]、脑肿瘤[3]、前列腺癌[4]、肺癌[5]、恶性黑素瘤等,但对食管癌干细胞的分离鉴定尚待研究。本实验室曾用无血清成球培养法从脑胶质瘤[7]和胃癌叫中成功地分离和鉴定了CsCs,因而我们尝试用该方法对食管鳞癌细胞系EC1O9巾的CsCs进行分离/富集,并从自我更新、分化潜能和致瘤性等方面对其“干性(stemness)”特性进行鉴定,以期为食管鳞癌干细胞的进一步研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

人食管鳞癌细胞系EC109购自中国科学院细胞库。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清和胰酶购自GBICO公司;B27购自Invitrogen公司;RNAiso Plus试剂为Takara公司产品;Polr Hema购白Siga公司;低粘附培养板购自Comi公司;反转录及实时荧光定量PCR试剂盒为Fermentas公司产品;Dct4、So2和Nalg一抗为abcam公司产品;CK13和CK18一抗购自北京中杉金桥生物技术公司;一抗稀释液购自碧云天公司。裸鼠由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1食管鳞癌细胞系EC109细胞的培养和传代按常规方法用含10%胎牛血清和105U/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养基,在37℃、5%C02及100%湿度的培养箱中培养,每2d传代一次。取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2成球培养用含0.02%EDTA的0,25%的胰酶消化单层贴壁培养EC109细胞,加人含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化,离心弃去上清液,加入含有B27(1×)的干细胞培养基(无血清的DMEM与F12以1:1比例混合)制各单细胞悬液。以1×105细胞/皿种于Poly Hema包被的250px培养皿或2×104细胞/孔接种于Corning公司低粘附6孔培养板,在37oC、5%C02及饱和湿度培养箱中培养。细胞球每5d用移液器反复吹打,机械性地分离细胞球细胞,以减少细胞球中心的细胞凋亡。生长1420d的细胞球用于实验。为除去凋亡细胞,将机械分离的细胞球细胞转移至普通培养吼,于含10%FBS的DMEM培养基中,常规培养条件下贴壁1h,移除未贴壁的凋亡细胞,收集贴壁细胞用于实验。

1.2.3平板克隆实验细胞球经含0,02%EDTA的0.25%的胰酶彻底消化后,加人含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化,离心弃去上清液,再以含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。然后以1O0细胞/孔接种于6孔板中,在细胞培养箱中静置培养14d。4%多聚甲醛室温同定,结晶紫染色,显微镜下观察并计数含50个以上细胞的克隆数目。

1.2.4实时荧光定量PCR按照RNAiso Plus试剂盒说明书,以RNAiso试剂裂解细胞,并提取总RNA。使用Formentas公司的RT与荧光定量PCR试剂盒及预先合成的引物进行反转录与扩增。所用引物序列为:

1.2.5免疫荧光细胞化学制备细胞爬片,4%多聚甲醛室温固定10min,1%牛血清白蛋白37℃封闭30min,加人一抗后37℃孵育30min,继以4℃孵育过夜。37℃复温后,加人荧光二抗37℃孵育30min,Hoechst33342染核,甘油封片,在激光共聚焦显微镜下观察结果并摄像。

1.2.6移植瘤实验以1×103、1×104和1×105个细胞球细胞与单层培养细胞分别接种于四周龄雌性裸鼠皮下。接种后第8周以引颈法处死小鼠,检测比较移植瘤的有无和大小,并作石蜡包埋切片和HE染色,光镜观察。

1.3统计学分析应用SPSS17.0统计软件进行数据分析处理。运用莎检验的统计学方法,以P<0,05判断为差异有统计学意义。

2结果

2.1 EC109细胞在无血清干细胞培养基中的成球生长EC109细胞在用无血清干细胞培养基和普通培养皿培养时,仍贴壁生长,即使添加成纤维细胞生长因子(nbroblast growth factor,FGF)和表皮生长因子(epidermal growth%ctor,EGF)也不能形成细胞球。当使用经PolrHema包被过的培养ll或低黏附板和无血清干细胞培养基进行悬浮培养时,会有一定比例的细胞球形成。经对成球培养条件进行优化后,EC109细胞在第3天出现折光性强的较小细胞球,至第5天长成较大的细胞球,细胞球经机械打散后进行传代培养,具有更强的成球能力,至少可传至第6代(见图1)。

2.2细胞球细胞干性相关转录因子表达的检测结果以实时荧光定量PCR的方法,从mRNA水平检测比较细胞球细胞和单层培养细胞常见干性相关转录因子Nanog、Oct4及Sox2表达的差异。结果显示细胞球细胞中0ct4的mRNA表达水平显著高于单层培养细胞,而Nanog及№r2的表达无显著差异(见图2)。

2.3平板克隆形成能力检测结果用平板克隆实验从细胞功能角度验证自我更新能力,细胞球细胞较单层培养细胞具有更强的克隆形成能力(见图3)。

2.4细胞球细胞分化潜能检测结果细胞球细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养14d,使其贴壁生长并分化。免疫荧光细胞化学检测细胞球细胞分化前后干性转录因子Sor2、Oct4、Nanog以及上皮分化标志CK13、CK18的表达变化。结果显示,№x2、Oct4和Nanog在分化后表达水平降低,而CK13和CK18在分化后表达水平升高(见图4),表明细胞球细胞具有分化潜能。

2.5细胞球细胞具有更强的移植瘤形成能力裸小鼠移植瘤实验表明,细胞球细胞比单层培养细胞具有更强的致瘤能力,见表1。1×10d个细胞球细胞可在部分裸鼠中形成移植瘤,而单层培养细胞需1×105个细胞才能在部分裸鼠中成瘤。处死小鼠后,对同一数量级所形成的移植瘤的体积大小进行比较,细胞球细胞形成的移植瘤的体积明显大于单层培养细胞所形成的移植瘤(图5,A,B),经HE染色,镜下见两者肿瘤呈鳞癌表现,但前者分化程度更低(图5,C,D)。

3讨论

CSCs的分离和鉴定是CsCs研究的前提。由于实体瘤组织中CSCs比例极低,分离、培养是个重要的技术瓶颈。就食管癌干细胞的分离鉴定而言,至今尚无成熟的方法,但近年来,已有一些学者进行了有益的探索。D.Huang等利用侧群细胞分选法,从EC9706禾口EC109~分离SP细胞,发现EC9706中存在外排Hoechst33342染料能力极强的SP细胞,称之为“Tlp”SP细胞。“Tip”SP细胞较非SP细胞具有更强的克隆形成和移植瘤形成能力,且高表达Oct准等干细胞相关基因,Wnt和Notch信号通路相关的主要基因也上调表达。但是受限于Hoechst染料的细胞毒性,使分选出的细胞难以用于深入的细胞生物学研究。T.Okumura等发现,低亲和性神经生长囚子受体(p75NTR)阳性的食管上皮细胞具有增殖、自我更新和多向分化能力,被认为是食管上皮干细胞的标志物。因此,S.D。Huang等尝试将p75NTR用作食管癌干细胞的标志物。结果显示,在EC109等4株食管癌细胞系中p75NTR阳性细胞占1,6%3.7%,并证实p75NTR阳性细胞具有白我更新和耐药的部分CSCs特性,但在成瘤能力上与p75NTR阴性细胞没有差异。新近文献报道,CD44可用作富集食管鳞癌细胞中的CSCs的标记物,CD狃阳Jl+细胞具有致瘤、分化、耐药及自我更新等部分CSCs的特性。但我们也曾用流式细胞仪检测过EC109细胞,CD44阳性细胞比例超过99%,许健等[13]发现,食管鳞癌细胞系TE1中所有细胞均表达CD44,因而CD44能否用作食管鳞癌CSCs的特异标志物还有待更多实验证明。我们在以往成功地用无血清成球培养法分离鉴定胶质瘤和胃癌CSCs的基础上,对食管鳞癌细胞系EC109中CSCs进行分离/富集,并获得成功。条件优化实验表明,成球培养法从EC109细胞系中分离/富集CSCs,需要在低黏附培养皿中进行,所用无血清干细胞培养基需要添加B27,但不需要添加生长因子等其他添加物。此外,适当控制细胞密度也是需要的,过密会引起大量细胞聚集而增加细胞凋亡,过低虽不影响成球,但会减少细胞球的收获量。干性特性鉴定结果表明,EC109细胞球具有明显的干性特征。细胞球细胞连续传代至第6代仍然具有旺盛的再成球能力,平板克隆形成实验显示细胞球细胞比单层培养细胞具有更强的克隆形成能力,说明细胞球细胞具有自我更新能力。将细胞球细胞置于含血清的正常培养基中培养后,Oct4等干性相关转录因子表达减少而上皮表型特征分子CK13和CK18表达上调,表明细胞球细胞具有分化潜能。体内成瘤能力被公认为鉴定CSCs的金标准,裸鼠移植瘤实验显示,EC109细胞球细胞较单层培养细胞具有更强的移植瘤形成能力,表明我们所获得的成球细胞富含食管癌干细胞。无血清成球培养法源自于1992年B,A.Rey∞lds等[14]建立的神经球形成方法。此后,该方法被用于体外检测脑组织中神经干细胞的存在,也被用于实体瘤中CSCs的分离/富集。除本实验室报道的胶质瘤和胃癌外,还有乳腺癌116]、肺癌「17]和结肠癌等。无血清成球培养法既避免了SP分选法中荧光染料的毒性问题,又避免了标志物分选法中所用标志物的特异性和可靠性常受质疑的问题,而且简单易行,成本低廉,易获得足够量的细胞球细胞用于后续实验。但成球培养法也有局限性,细胞球细胞并非单一细胞,其中会含有相当数量的祖细胞。

参考文献

[1]Bonnet D,Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nature Medicine,1997,(07):730-737.

[2]Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2003,(07):3983-3988.

[3]Singh SK,Clarke ID,Terasaki M.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J].Cancer Research,2003,(18):5821-5828.

[4]Collins AT,Berry PA,Hyde C.Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells[J].Cancer Research,2005,(23):10946-10951.

[5]Ho MM,Ng AV,Lam S.Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells[J].Cancer Research,2007,(10):4827-4833.

[6]Fang D,Nguyen TK,Leishear K.A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas[J].Cancer Research,2005,(20):9328-9337.

[7]Yu SC,Ping YF,Yi L.Isolation and characterization of cancer stem cells from a human glioblastoma cell line U87[J].Cancer Letters,2008,(01):124-314.

[8]Yang L,Ping YF,Yu X.Gastric cancer stem-like cells possess higher capability of invasion and metastasis in association with a mesenchymal transition phenotype[J].Cancer Letters,2011,(01):46-52.

[9]Huang D,Gao Q,Guo L.Isolation and identification of cancer stem-like cells in esophageal carcinoma cell lines[J].Stem Cells and Development,2009,(03):465-473.

[10]Okumura T,Shimada Y,Imamura M.Neurotrophin receptor p75(NTR)characterizes human esophageal keratinocyte stem cells in vitro[J].Oncogene,2003,(26):4017-4026.