siRNA沉默EGFR基因对ACHN肾癌细胞恶性生物学行为及放疗敏感性的影响

肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿系常见肿瘤,其发病率呈上升趋势，2010年其发病率约占成人恶性肿瘤的3.8%，占肾脏肿瘤的90%-95%。随着 影像学技术水平的提高，提高了部分早期肾癌患者的预后生存率，但仍有一部分晚期及发生转移的肾细胞癌患者治疗预后并不理想。肾癌细胞对放化疗均不敏感，这 一难题已成为当今肾癌治疗的热点。表皮生长因子受体EGFR已被证实在肾癌中超表达，其表达可能与肾癌对放化疗不敏感有关系，针对EGFR的治疗有望改善 肾癌对放化疗不敏感的现状，为晚期肾癌患者带来了希望。RNAi作用机制是由互补的内源或外源RNA形成的双链RNA诱发基因沉黙。RNAi具有高特异 性、高效性、高稳定性、可遗传性等特点，其在肿瘤的基因的研究和治疗方面已表现出了强大的潜力。RNAi给肿瘤的治疗带来了广阔的前景，将RNAi技术联 合放疗以增加对肿瘤细胞的杀伤力，且毒副作用小，为肿瘤的治疗开辟一条新途径。本实验课题，利用RNAi技术沉默ACHN肾癌细胞中的EGFR基因，抑制 了ACHN肾癌细胞株的增殖、迁移、侵袭能力，并增加了其对放疗的敏感性，为临床肾癌的治疗提供了新的途径，并奠定了理论基础。

1资料及方法

1.1临床资料

肾癌组织标本取自2011年1月一12月安徽 医科大学第二附属医院泌尿外科.共20例，分别取肿瘤组织和正常肾组织。所有患者术前均未做放化疗治疗。其中男15例，女5例，年龄41-78岁，平均60. 9岁:左肾癌10例，右肾癌10例;病理均为肾透明细胞癌.远处转移3例。依照2o0a年 AJCC肾癌TN NI分期:工期10例，11期6例.111期 1例，互期3例。根据Fuhrman标准分级:工级。例.II级16例，III级4例.IV级0例。 人肾细胞癌细胞株(ACHN)购于中国典型培养保藏中心，胰蛋白酶、RPMI-16f10细胞培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自Hvelone公司· 羊抗兔IGG二抗、兔抗人汁action多克隆抗体、四甲基偶氮哩盐(MTT)和DAIS显色试剂盒购自美国Sigma公司，兔抗人EGFR单克隆抗体购自 Cell Signaling公司，Lipofectamine-2000转染试购自 Invitroge公司·RIPA组织细胞裂解液购自碧云天公司。鼠抗兔荧光二抗购于iUIolecular probes公司。

1.2方法

采用免疫组化技术检测EGFR在组织中的表达情况。10%福尔马林溶液固定的肾癌组织标本经石蜡包埋厚4mm连续切片，附着于载玻片上. 空气中干燥.然后烤箱中95℃加热10 min。二甲苯脱蜡后经梯度乙醇水化，用3 m1/L的过氧化氢溶液抑制内源性过氧化物酶，进行抗原修复;切片浸泡在构椽酸缓冲液(pH 6. 0)中微波炉加热修复 10 min后，正常山羊血清封闭，加人EUFR(工作浓度1 ：200)后，37℃孵育30 min，置4 0℃冰箱中过夜。次日PBS充分洗涤5 min X 3次，滴加生物素标记二抗工作液，3 7 ℃或室温孵育30 min。 PBS 冲洗5minX3次，滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，3 l ℃或室温孵育15 min。PBS冲洗， smin X 3次，3 7 ℃孵育15 min, PBS漂洗之后 DAB显色，苏木精复染、乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。 应用细胞免疫荧光技术检测ACHN肾癌细胞中EGFR的表达情况。制作细胞爬片，选择适当密度的细胞爬片进行细胞固定，将带有细胞的爬片用PBS快速洗3次，用4%的多聚甲醛固定10 min，后再用PBS洗三次，一次3 min，用2%的 Triton X-100透化穿膜5min，将透化后的盖玻片无细胞面擦干，用指甲油粘在载玻片上，加含500 FBS和0.1% Tween-20的PBS于盖玻片细胞面，常温放在湿盒中30 min，加一抗，封口膜覆盖放人 4℃冰箱过夜。PBS洗三次，加荧光二抗，室温60 min, PBS洗3次，DAPI染色，将吸水纸将DAPI 液吸干，加抗淬灭剂，封片。 将EGFR siRNA转染进人ACHN肾癌细胞系。siRN A的设计及合成，根据siRNA的设计原则并参考文献(5,6)选取针一对EGFR的特异性 siRNA序列:senses5'-GAAGGUGAGAAAG- UUA A AAUI?CCTT一3'，阴性对照siRNA序列: senses=UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'.以上RN A序列均由上海吉玛制药公司化学合成。 细胞培养分组及siRNA转染:ACHN置于含 10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置于Cn:体积分数 5%/37℃湿度条件下培养。实验分为空白对照组、阴性对照组(加人为siRN A及转染试剂)、EGFR- siRNA组(加人EGFR-siRNA及转染试剂)。取对数生长期细胞，用胰酶消化调节细胞浓度后接种于P30细胞培养皿中。细胞生长至70% -80% 时。按照脂质体I_ipofeetamine-2000转染试剂盒操作步骤进行、iRNA转染。继续培养。转染4-6 小时后换液.根据实验需要收集细胞。 Western印迹检测EGFR的表达:依据上述分组。RNA干扰72小时后，用PBS漂洗细胞两遍。收集细胞，用组织蛋白裂解液裂解细胞，置入冰上 30 min·以10 000 r/imin速率离心2 min。取上清 10UL，加人等体积的2X上样缓冲液，震荡，煮沸5 min。用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。定量后上样.SDS-PAGE凝胶电泳，l50 V电泳嗅酚蓝至凝胶底部。320 mA恒流2 h后，将蛋白转移至 PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭液于4 `C封闭过夜。TBST漂洗3次，加人兔杭人EGFR单抗(1}7 000),孵育2h，用TEST洗膜3次。加二抗，于室温孵育1 h . TBST洗膜，显色。 对细胞进行放疗处理。再次培养ACHN细胞，分为空白对照、非特异性RNA干扰组、特异 RNA干扰组，转染方法按上述方法进行。24小时后传代并接种到16个P30皿里。实验分组:按放射剂量分为。,2,4,6,8 Gy五个组，每个组中包含空白对照、非特异性RNA干扰组、特异RNA干扰组。siRNA转染后的第72小时行放射处理。 倒置显微镜下观察细胞形态变化及凋亡情况。台盼蓝拒染法检测放疗后细胞凋亡率:将经辐射后的每组细胞消化接种到24孔板，每组复3孔，常规培养48小时后，配置台盼蓝工作液，将细胞消化后，将细胞混悬液与台盼蓝工作液1，1混匀，室温静置 3 min，用细胞计数板计数染色的凋亡细胞数目。

1.3统计学处理

各数据用均数士标准差(x士s)表示。应用 SPSS 13.0分析软件包，采用t检验或方差分析比较组间差异。以P <0. 05为差异有统计学意义。

2结果

我们应用免疫组化技术对所收集的20例病例组织进行染色，显微镜下观察EGFR在肾癌中的表达情况，发现肾癌组织的EGFR呈膜表达，而正常肾组织则为胞质表达，与Pu等所研究结果 Western blot检测RNAi EGFR后蛋白表达情况，siRNA转染后EGFR表达情况明显低于对照组及阴性对照组，说明ACHN细胞中高表达 EGFR，经转染处理后，肾癌ACHN细胞的EGFR 含量明显降低(图3). 放疗后48小时在显微镜下我们观察到，随着辐射剂量的增加，漂浮的死亡细胞数量随之增加，贴壁肿瘤细胞数目也逐渐减少。与空白组相比，我们发现RNAi联合放疗组的细胞死亡数目明显增加，细胞贴壁数目明显减少，RNAi联合辐射剂量为6 Gy组及8 Gy组最为明显，漂浮的细胞明显增多(图4)。 台盼蓝染色计数RNAi沉默EGFR基因后放疗对ACHN肾癌细胞的杀伤力见图5. 3讨论 肾癌是泌尿系统常见的肿瘤之一，近年其发病率及死亡率均呈逐年增加趋势，虽然外科手术治疗已成为治愈早期肾癌可能手段，但对于部分中晚期肾癌效果不佳，而肾癌对放化疗不敏感，使得放疗成为晚期肾癌姑息性治疗方法。因此，寻找放疗的增敏方法成为研究的热点。放疗是通过电离辐射 直接和间接的作用导致DNA碱基损伤、单链和 (或)双链断裂以及DMA链交联，造成肿瘤细胞 膜、胞浆蛋白及DNA的损伤，激活、下调肿瘤相关基因的表达，从而改变相关生物大分子的特性，干预了细胞膜、细胞核和胞浆内的信号转导途径.导致细胞周期停滞、氧化应激及细胞凋亡，并降低 DNA修复功能。在DNA损伤感受器、细胞周期检测点、DNA损伤修复、氧化应激调节酶类和细胞凋亡途径的相关调节蛋白，均可能成为影响放疗敏感性的潜在靶点，而作为与上诉环节密切相关的 EGFR，已成为目前肿瘤放疗增敏研究领域研究的热点。 EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，在许多实体肿高表达，如头颈部肿瘤、肺癌、结直肠癌、‘肾癌、膀恍癌等，其中50%-90%的肾癌中高表达EGFR' , EGFR与肿瘤细胞的增殖、生长、转移、侵袭及放化疗耐受中相关，所以针对EGFR进行基因治疗成为近年研究的热点。EGFR在肿瘤细胞中的高表达与对放疗敏感性呈负相关.Aki- moto等研究发现EGFR高表达的肿瘤其对放疗敏感性差，在EGFR高表达的肿瘤中，放疗可以激活EGFR的自身磷酸化，并增加了酪氨酸蛋白激酶的活性，有利于肿瘤细胞的分化、增殖、迁移等此外，放疗联合EGFR靶向治疗药物可增加细胞毒性并降低细胞浸润与迁徙。

Gorski等研究发现抗EGFR单克隆抗体与放疗联合应用的抗肿瘤作用，可因其加强EGFR的信号抑制作用，进一步增强了放疗产生的细胞毒作用。Zhang将西妥西单抗联合放疗对人肺鳞癌细胞进行体外实验研究，结果显示西妥西单抗可以增加肿瘤细胞对放疗的敏感性，导致肿瘤细胞大量凋亡，其机制为西妥西单抗阻断了PI3K通路，减少了AKT的磷酸化，活化了caspase-9，并在凋亡过程中用caspase-3 水解肿瘤细胞的DNA，最终使细胞凋亡。Ditt- mann等在探索EGFR对放疗耐受机制时，发现肿瘤细胞经放射治疗后，EGFR则被辐射激活并向细胞核内转移，与DNA-PK-tein kinase)的激活相关，而西妥西单抗可与EGFR 胞外区域结合，阻止了EGFR进人细胞核，使细胞质中DNA-PK增多，但核内不足，从而使肿瘤细胞不能有效修复DNA损伤而增加辐射敏感性，他们还提到EGFR的下游通路，如PI3K通路，也与肿瘤对放疗敏感性差有一定关系。Joensuu等选取了42例前列腺癌患者，口服EGFR靶向治疗药物吉非替尼联合放射治疗，结果显示联合治疗耐受性好，总体生存率较单独放疗高。EGFR靶向药物的广泛应用对某些肿瘤的治疗带来希望的同时又出现了部分肿瘤对EGFR靶向治疗药物耐药的新难题。Siddiqui等研究分析了结肠癌患者对西妥西单抗耐药情况，发现EGFR下游通路中的 KRAS基因的突变导致了结肠癌细胞对西妥西单 抗的耐药性，表达野生型KRAS基因的结肠癌患者使用西妥西单抗联合化疗治疗效果较突变型 KRAS效果好。Gazdar总结分析并研究针对非小细胞肺癌治疗中出现的EGFR靶向治疗耐药情况，肺癌耐药性一与T790M,D761Y突变或其他受体通路的活化(如IGF-1 R, FGFR, PDGFR等)相关。 随着生物学技术尤其基因治疗的发展，对放疗增敏机制研究的深人，有效的将肿瘤基因治疗一放射治疗相结合，可以降低等效放射剂量，减少正常组织的损伤，减少放疗副作用的产生，这种“基因放疗”成为是肿瘤研究及治疗领域的趋势，其中以 RNAi基因治疗技术为基础的“基因治疗”成为研究的热点。本实验中我们推断，应用RNAi技术沉默EGFR表达后放疗敏感性增加可能与阻止EG- FR下游相关通路的激活，阻碍EGFR向核内的转移，使DN:}损伤不能够得以修复有关。

RN Ai作用机制是由互补的内源或外源RNA 形成的双链RNA诱发基因沉然。RNAi具有高特异性、高效性、高稳定性、可遗传性等特点，其在肿瘤的基因的研究和治疗方面已表现出了强大的潜力。OGrady等一1舀一应用RNA干扰技术沉默宫颈癌细胞的EGFR研究增加对小分子酶抑制剂的治疗效果，发现RNAi后可以克服肿瘤细胞对小分子抑制剂的耐药情况，并降低了药物用量，减少了副作用的出现。Zhuang等用RNAi技术沉默脑膜胶质瘤的DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs) 基因.探索干扰后对放疗敏感性，发现干扰后肿瘤细胞对放疗敏感性增加，细胞大量凋亡。RNAi给肿瘤的治疗带来了广阔的前景，将RNAi技术联合放疗以增加对肿瘤细胞的杀伤力，且毒副作用小，为肿瘤的治疗开辟一条新途径。 本实验将RNA干扰技术与肿瘤放疗耐受研究热点—信号受体的研究相结合，采用RNAi技术阻断导致辐射耐受的信号受体EGFR基因，发现干扰加辐射组对放疗的敏感性高于单纯辐射组。从分子生物学水平证实了EGFR基因沉默能够提高ACHN肾癌细胞的放疗敏感性，显示了RNAi 技术在肾癌基因增敏放疗中的巨大潜力，为完善 RNAi技术放疗增敏的临床前研究提供的一定的理论甚础.为肾癌前疗增敏提供有力的证据。

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