P62、PCNA 在结肠癌中的表达及其与抗核抗体的相关性研究

结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，目前其发病率正不断上升。同所有的癌症一样，早发现早诊断对于结肠癌患者的预后有重要意义。P62 基因是采用肝癌患者血清自身抗体筛选cDNA 基因表达文库，分离得到的一个全长约3.7kb，开放阅读框架(ORF)为1.7kb的cDNA 克隆[1]。常见的恶性肿瘤中都有PCNA 的异常表达，其表达水平与肿瘤细胞增殖有关，反映了细胞的增殖活性。抗核抗体(ANA)是针对细胞抗原成分的自身抗体的总称，是目前诊断自身免疫性疾病的重要指标，恶性肿瘤患者中也存在着自身免疫现象。在有些情况下，检测到自身抗体可为肿瘤的诊断提供依据。本研究旨在通过对P62、PCNA 表达水平和血清ANA 抗体水平的检测，探讨其相互关系的，为肿瘤的早期诊断、恶性程度判断、预后评估提供一定帮助。

1　资料与方法

1.1　一般资料　2008～2010 年本院收治的行结肠癌根治术的患者64例，其中男40例、女24例，年龄28～75岁，平均56岁。本院同期收治的42例结肠腺瘤患者，其中男30例、女12例，年龄26～71岁，平均52岁。上述患者的病理标本均经过病理学确诊，术前均未接受放疗、化疗。

1.2　仪器与试剂　鼠抗人PCNA 单克隆抗体、SP 试剂盒、DAB显色盒均购自福州迈新生物公司;P62 抗原和抗体均由美国德克萨斯州大学生命科学系肿瘤免疫和肿瘤分子流行病学研究室提供;包被有Hep2 细胞的免疫荧光生物薄片为德国欧蒙公司产品。

1.3　方法

1.3.1　免疫组织化学检测　采用过氧化物酶SP 法对病理科制作的上述患者的石蜡组织标本进行常规免疫组化检测。P62主要为胞质着色，胞质出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞，不着色为阴性细胞。PCNA 以细胞核被染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞，在高倍镜下计数100个肿瘤细胞，其中阳性细胞个数与细胞总数的百分比记作PCNA 标记指数。

1.3.2　ELISA 检测血清中抗P62 抗体的阳性率　样品血清每份做2 个复孔，取平均值进行结果判断;50 例健康者血清OD 值的平均值加2 个标准差判断为临界值，即为截断(Cutoff)值，高于此值的为阳性，小于或等于此值则为阴性。

1.3.3　间接免疫荧光检测ANA　严格按试剂盒说明书进行操作，滴度大于或等于1∶40者报告为阳性。

1.4　统计学处理　采用SPSS11.0 统计软件进行数据分析，计量资料以狓±狊表示，采用两两比较的狋检验进行分析;计数资料以率表示，组件率的比较采用配对χ 2检验;p<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　P62抗体检测结果　对64例结肠癌患者、42例结肠腺瘤患者的血清标本进行P62 抗体检测，结肠癌患者P62 抗体检测的阳性率为23.4% (15/64)，结肠腺瘤患者的阳性率为4.8%(2/42)，两类患者血清P62抗体检测阳性率的差异有统计学意义(p<0.05)，阳性结果均采用Westernblot法进行确认。

2.2　P62、PCNA 在不同组织标本中的表达情况　结肠癌组织的P62 阳性率和PCNA 标记指数均高于结肠腺瘤组织。

2.3　ANA 检测结果　结肠癌血清组ANA 的阳性率为82.8%(53/64)，滴度普遍较高，与结肠腺瘤患者比较，差异有统计学意义(p<0.05)。

3　讨　　论

肿瘤自身抗体可以作为细胞癌变过程中的报告分子，对于监控肿瘤的发展有着重要作用[24]。以往的研究表明，常见的恶性肿瘤患者血清中存在抗P62 自身抗体[56]。本研究通过ELISA 法检测到结肠癌患者血清P62抗体的阳性率明显高于结肠腺瘤患者，同时笔者还采用免疫组化方法研究P62 在结肠癌组织中的表达，发现结肠癌组织标本的P62 阳性表达率高于结肠腺瘤组织。P62可能和肿瘤细胞的恶性转化相关，它在结肠癌的检测中有望成为潜在的肿瘤标记物。肿瘤细胞的增殖活性是决定肿瘤生物学行为的一个重要指标[78]。PCNA的表达水平反映了肿瘤细胞的增殖活性。在风湿性自身免疫病中，自身抗体对于某种疾病具有较高的特异性，而大多数的肿瘤自身抗体则不具备这种严格的特异性。研究表明肿瘤细胞能直接诱导机体产生ANA，其没有种属!构象和序列特异性，癌症患者有较高的自身抗体检出率，某些由肝炎、肝硬化发展成肝癌的患者会出现ANA 由阴性到阳性变化的现象。这种自身抗体是由于细胞癌变过程出现的蛋白刺激机体产生的，在某种情况下，检测到自身抗体也可为肿瘤的诊断提供依据[9]。本研究表明，结肠癌患者血清ANA阳性率和滴度较结肠腺瘤患者增加。虽然一定比例健康者血清中也存在着生理性的ANA，但结肠癌患者的血清抗体谱更宽，荧光核型更加丰富，且胞浆和核仁阳性率显著高于结肠腺瘤患者。核糖体蛋白是与细胞生长增值过程密切相关的蛋白，提示结肠癌患者体内的自身抗体相应的靶抗原可能与细胞恶转和异常增值有关，因此ANA 的检测可为结肠癌的早期发现提供帮助。检测到的ANA 是由哪种具体的肿瘤相关抗原引起的还有待进一步的探讨。综上所述，P62、PCNA 在结肠癌组织中的表达明显上调，PCNA 与细胞的增殖密切相关，结肠癌患者血清ANA 阳性率和滴度明显增加，因此将三者结合起来对结肠癌的早期诊断、肿瘤的恶变及预后监测及分子靶向治疗有着重要意义。

参考文献

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(收稿日期：20131213)