RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究现状

RNA干扰(RNAi)技术是利用双链RNA(dsRNA),高效、特异性降解细胞内同源信使RNA(mRNA),从而阻断特定基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。1998年Fire等[1]首次应用RNAi技术将dsRNA正义链与反义链的混合物注人线虫体内,结果发现注人dsRNA比单独注人单链RNA引起的基因沉默要强得多,并可导致子一代同源基因的沉默。2001年Elbashir等[2]在哺乳动物细胞中首次观测到了RNAi现象,从而开启了RNAi技术在哺乳动物细胞中应用研究的闸门,使RNAi赶技术迅速成为后基因组时代基因功能研究和基因治疗研究领域最热门的研究工具之一,进而得到广泛应用。迄今为止,RNAi的确切机制尚不清楚。经过10多年的研究,一些细节逐渐展现在人们面前。本文就现阶段RNAi已知的可能机制及RNAi技术在肿瘤基因治疗中的研究现状作一综述。

1  RNAi的作用机制

有关RNAi现象的机制研究主要集中在线虫、果蝇等低等动物,许多研究初步阐明了RNAi抑制mRNA转录与翻译的分子机制[3-4]:在RNAi引起基因沉默的过程中,细胞内具有核糖核酸酶Ⅲ(RnaseⅢ)活性的核酸酶Dicer首先识别外源性或内源性dsRNA,将其切割成21~23nt大小的siRNA(siRNA);随后siRNA与无活性的RNA诱导沉默复合物(RISC)结合,在解螺旋酶的作用下siRNA双链解开为单链;由于siRNA与mRNA具有高度同源性,其反义链通过与靶基因mRNA进行特异性结合使RISC活化,最后将靶基因mRNA剪切成碎片。同时,siRNA还可作为合成扒RNA的引物,引物“RNA与靶基因mRNA模板结合后,在RNA依赖性RNA聚合酶的催化下,合成新的dsRNA,后者被Dicer剪切成新的siRNA,从而产生级联放大效应,增强靶基因的沉默效应[4]。此外,slRNA还可引起同源基因组DNA产生RNA定导甲基化、基因缺失、表型缺陷等系列分子生物学效应[7],进一步强化基因沉默效应。

2  RNAi技术在肿瘤基因治疗中的研究现状

肿瘤是机体在多种致癌因素作用下,局部组织细胞内的癌基因与抑癌基因表达失衡,引起细胞分裂与生长的多基因调控网络失调,导致细胞异常分裂、生长与分化而形成的病理性新生物。因此,只针对单个突变基因进行的肿瘤基因治疗,效果并不明显。Matsui等[8]研究发现,RNAi技术对于内源性和外源性基因都有明显的沉默作用。因此,利用同一基因家族的多个基因具有高度保守同源序列的特性,通过RNAi技术设计一种特异性的dsRNA分子,就可以同时剔除多个同源基因,从而达到肿瘤基因治疗的目的。此外,RNAi能同时抑制肿瘤多个不同的基因,而且抑制作用互不影响,这就为由于多基因改变和多因素引起的肿瘤的治疗提供了可能[9]。目前,RNAi对肿瘤进行基因治疗主要集中在肿瘤发生和肿瘤转移相关基因(如癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因)以及与肿瘤耐药基因、细胞凋亡、信号转导、有丝分裂有关的基因方面。

2.1  RNAi对肿瘤发生与转移相关基因的沉默作用  基于RNAi技术在基因功能沉默与功能抑制中的优势,利用该技术抑制肿瘤细胞内癌基因的功能表达,分析其表型变化,可以帮助进一步发现肿瘤发生与发展的分子机制,为肿瘤的基因治疗提供可靠的理论依据。

沉默信息调节因子2同源蛋白(SIRT1)是一种涉及从肿瘤发生到衰老多个层面不同细胞过程的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白去乙酰酶,在肝细胞性肝癌和肝细胞癌细胞株中均高表达。Choi等[10]通过RNAi技术用化学合成的siRNA沉默肝癌细胞中SIRT1基因的表达,发现肝癌细胞的生长与细胞周期进程被有效阻滞。核小体结合蛋白-1(NSBP1)是HMGN蛋白家族成员,能够结合核小体并通过染色质重建调节基因转录,NSBP1的表达与肿瘤分级、病理分期和淋巴结转移密切相关;NSBP1基因的过表达促进癌细胞的生长与转移,增强癌细胞的侵袭力。Wahafu等[11]研究结果显示,导致癌细胞生存率降低、细胞周期素Bl表达降低、细胞周期被阻滞在G2/M期。血管内皮生长因子(VEGF)在血管发生、内皮细胞形成和增殖中发挥重要作用。内皮癌时,由于VEGF分泌增多,从而促进了内皮细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡和诱导血管透化。研究发现,人结直肠癌患者体内的血管内皮生长因子A(VEGFA)表达常常过高,它还与肿瘤的进行性和侵袭力相关。Qiu等[l2]采用慢病毒包装针对VEGFA基因的RNAi载体,并导人结直肠癌细胞RKOceIl后发现,VEGFA表达被抑制后,可以抑制肿瘤细胞的生长、迁移和增殖。另外,VEGFA基因沉默也可以减少促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号肽和第2个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂/低等电点凋亡抑制蛋自直接结合蛋白(Smac/DIABLO)的表达,这都说明了用RNAi的方法沉默VEGFA表达,可以成为治疗结直肠癌的一种基因治疗方法。这些研究表明,利用RNAi技术沉默或者关闭与肿瘤发生相关的基因,可能是今后肿瘤治疗的一种新的策略。

2.2  RNAi对肿瘤耐药相关基因的沉默作用  除手术治疗外,放疗和化疗在肿瘤的治疗中是最重要的两种辅助治疗方法。恶性肿瘤复发与化疗效果不佳甚至失败有重要关系,影响化疗效果的主要原因是肿瘤细胞容易产生耐药性,表现为原药耐药和多药耐药。采用RNAi的方法可以减少肿瘤的耐药性,增加肿瘤对放、化疗药物的敏感性。

多药抗性蛋白质1/P糖蛋白(MDR1/P-gp)的过表达被认为与肿瘤组织多药抗药性相关。上皮-间质转化及其转录调控因子(Twist1)是一种高度保守的转录蛋自,属于螺旋-环一螺旋蛋白家族,在上皮细胞-间充质细胞转换中发挥重要的调节作用,从而可以促进肿瘤发生转移。Zhu等[13]首次发现了Twist1和MDR1/P-gp的关系,他们在人宫颈癌HeLa细胞中通过RNAi的方法干扰Twisd的表达后发现可以下调MDR1/P-gp的表达,可以抑制肿瘤细胞增殖和增强肿瘤细胞对顺铂化疗的敏感性。

研究发现,细胞周期蛋白d1(cyclin D1)与多种肿瘤治疗过程中的化疗抗药性和放疗抵抗有关。Kothari等[l4]通过RNAi的方法沉默cyclin D1基因在头颈部鳞状细胞癌的表达,然后检测细胞对顺铂的敏感性,发现沉默了cyclin D1基因的肿瘤细胞周期延迟,减慢了肿瘤进展,并且对顺铂的敏感性提高。

2.3  RN凡对细胞凋亡相关基因的沉默作用  细胞凋亡是受许多基因调控的细胞清除的正常途径,细胞凋亡调控基因的表达紊乱与许多肿瘤的发生密切相关。B细胞淋巴瘤-白血病-2蛋白质家族(Bcl-2)、B细胞白血病-长xBcl-2家族成员之一(Bcl-xL)、surviving、X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和FLICE抑制蛋白(FLAP)是常见的抗凋亡蛋白,通常在肿瘤细胞中过量表达,刺激肿瘤细胞异常生长,对凋亡诱导因素产生抵抗作用。因此,不断寻找新的抗凋亡蛋白然后利用RNAi技术沉默或下调肿瘤细胞中抗凋亡蛋白的表达,对肿瘤治疗具有重要的理论意义和实践价值。

许多研究证实,survivin基因在肿瘤细胞中过表达,抑制survivin基因的表达,能够导致多种肿瘤的生长抑制。Wang等[15]利用RNAi技术将针对survivin基因的dsRNA转入食管鳞状细胞癌细胞系和动物模型中,结果发现,下调survivin基因的表达,能够显著诱导肿瘤细胞凋亡、抑制动物模型实体瘤的生长。XIAP是凋亡抑制蛋白家族的重要成员,能够选择性抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、-7、-9,还能通过其他途径抑制细胞凋亡,与肿瘤的发生、发展和预后关系密切。Hiscutt等[16]根据美国联合委员会癌症分期系统标准对55例皮肤原发性黑色素瘤细胞病变进行筛选和分组,通过XIAP特异性siRNA干扰黑素瘤细胞中XIAP的表达,发现XIAP的表达促进黑色素瘤细胞病变的进程,XIAP的沉默或表达下调显著诱导黑色素瘤细胞的凋亡,提示XIAP可以作为黑色素瘤基因治疗的一个有效的治疗靶点。

2.4  RNAi对肿瘤信号通路相关基因的沉默作用肾素一血管紧张素系统(Ras)、肿瘤抑制蛋白(p53)、酪氨酸蛋白激酶类(PTKs)信号通路是肿瘤发生常见的信号通路。PTKs是重要的细胞信号转导分子,在人类多种肿瘤发生过程中常常发生突变,通过基因重排如染色体易位产生潜在的致癌性结合蛋白,导致细胞在激酶活性水平发生改变。断裂点聚集区-Abelson小鼠白血病病毒癌基因同源物结合蛋白(Bcr-Abl)是PTKs的一种突变产物,在人类慢性白血病细胞内普遍存在,用siRNA特异性沉默Bcr-Abl的转录,可以诱导白血病细胞凋亡[17]。β-连接素和腺瘤结肠息肉蛋白(APC)都是Wint信号通路的重要成员,与细胞增殖调控密切相关。APC基因突变会上调连接素的表达水平,促进肿瘤细胞增殖。运用siRNA技术沉默β-连接素的表达可以引起β-连接素依赖性相关基因的表达下调,从而抑制肿瘤细胞的生长[18]。以上研究提示,可以运用RNAi技术沉默肿瘤信号通路中的关键或相关基因的表达,达到肿瘤基因治疗的目的。信号传导蛋白和转录激活物5(Stat5)在人的多种肿瘤中被发现高表达。抑制肿瘤细胞中Stat5的表达被认为与抑制肿瘤细胞的增殖和促进凋亡相关。Zhang等[19]以人的肝细胞癌细胞系sMMC7721为细胞模型,检测到Stat5在sMMC7721细胞中高表达,然后发现用RNAi介导的Stat5基因沉默可以抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。

2.5  RNAi对肿瘤细胞有丝分裂相关基因的沉默作用  肿瘤细胞的无限繁殖伴随着细胞DNA的快速复制与细胞分裂的不断进行,利用RNAi技术沉默肿瘤细胞周期调控基因,中断细胞分裂进程,减慢或停止肿瘤细胞增殖,从而使肿瘤根治成为可能。日前研究较多的肿瘤细胞有丝分裂调控基因有polo样激酶l(Skp-2)、细胞周期素(cyclins)等。PLK1在细胞分裂不同时期都具有十分重要的作用,能够促进和加速有丝分裂,增加PLK1的活性能够促进M期细胞增殖。Spankuch-Schmitt等[20]用RNA干扰技术分别沉默乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌细胞系中PLK1的表达,许多癌细胞出现了纺锤体形成受阻、有丝分裂停止等微观形态变化。SKP2是细胞从Gl期进人S期的必需因子,能够促进细胞增殖,加速细胞周期进程,与肿瘤的发生、发展关系十分密切。研究发现,当用RNAi技术沉默人小细胞肺癌细胞中SKP2的表达,癌细胞的生长则受到明显的抑制[21]。细胞周期素是细胞周期进程的主要引擎分子,在细胞增殖过程中发挥关键调控作用。研究证明,通过RNAi方法沉默裸鼠肝癌细胞中细胞周期素E(cyc1inE)的表达,可以抑制癌细胞生长与增殖,促进癌细胞凋亡[22]。纺锤体驱动蛋白(KSP)是微管驱动蛋白超家族的成员之一,在有丝分裂中关于纺锤体的形成、分布和维护中发挥重要作用。若抑制KSP的功能,可以使细胞有丝分裂周期停滞,最终导致细胞死亡。Marra等[23]通过电转移法转染siRNA进人某些确定损伤的组织中发现,KSP特舁性的小干扰RNA可以显著减轻皮下黑色素瘤和卵巢癌的损害。

3  RNAi技术在肿瘤基因治疗方面的主要问题与前景展望

目前,RNAi技术在肿瘤基因治疗方面仅仅停留在细胞与动物实验水平,虽然显示出种种优势与可行性,但还存在着许多不容忽视的问题,离实际应用还有漫长的路要走。首先,RNAI对基因沉默具有相对特异性,可能出现脱靶现象[24]。这就需要从siRNA的设计、特异性修饰等方面来改善。其次,siRNA的设计和筛选上还存盲目性。一种完全符合肿瘤基因治疗要求的siRNA需要经过反复实验才能筛选出有效作用位点,这一现状需要更多的实验研究从实验原理和技术方法上来加以完善。此外,siRNA导人肿瘤细胞后可能与细胞内原有微RNA(miRNA)形成竞争,这种竞争作用可能会影响肿瘤细胞内原本由miRNA控制的一些基因的表达,从而影响细胞的生理病理过程[25],这就要求不断发现和深人研究新的miRNA序列,以解决siRNA与miRNA间的竞争问题。最后,siRNA体内转染效率低下、对机体的长期影响尚属空白,这是RNAi技术应用于临床的最大难题。各类表达载体的安全性及合成RNA的不良反应,也限制了其应用于临床[16]。

传统的肿瘤治疗方法如放、化疗存在着诸多局限性,随着RNAi的发现,为肿瘤的基因治疗带来了希望之光。RNAi技术在肿瘤基因治疗的实验研究上已经取得了诸多成果,有望在此基础上研究出治疗肿瘤的核酸药物,单独或者与其他方法联合用于治疗肿瘤。虽然,目前RNAi技术应用于临床还有一定的距离,但有理由相信随着新靶标的不断发现、RNAi技术难题的不断破解和安全性的不断提高,肿瘤基因治疗的目标终究会实现。

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