核因子IA在神经角质细胞瘤中的表达及与患者生存的关系

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,占人类所有原发性颅内新生物的40％~50％［1］。在各年龄组的发病率和死亡率都很高,但是对其预后的研究仍然较少［2~4］。传统胶质细胞瘤,依靠细胞形态学或细胞培养来分类［5］。据世界卫生组织（WHO）的分类系统,神经胶质瘤可细分为星形细胞瘤,少突胶质细胞,或混合少突胶质细胞等。专一位点DNA结合蛋白（也被称为CTF或CATT box转录因子）的核因子I（NFI）家族在神经系统的发育中具有关键调节作用［6-7］。NFIA是NFI值家族的成员之一,在鼠类和鸟类心室发育中具有关键的作用已经被证明。并且已知NFI基因在大鼠的脑和脊髓星形胶质细胞分化中具有关键调节作用,其机制可能是通过转录调控的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达来发挥作用［8］。此外,在出生后的小鼠大脑中切除NFIA或NFIB,中线的神经胶质细胞群就会产生发育缺陷［9］。事实上,NFIA在人胎儿前脑的中线结构中也表达［10］。NFI基因在神经胶质细胞的发育过程中,表现出动态的表达方式［11］。在胚胎角质的发生过程中,NFI基因的表达在所有胶质前体的发展过程中,他们在少突胶质细胞系中发生转录抑制,他们的表达维持了星形胶质细胞的特征。这样的模式,有可能被用来识别存在沿轴线不同点分化的细胞。此外,NFIA参与神经胶质发展的事实表明,它可能会在神经胶质肿瘤发生改变,甚至可能在脑胶质瘤发展中发挥重要作用。因此,我们检测可能在胶质瘤中发挥作用的NFIA,我们分析了神经胶质肿瘤的NFIA在表达及其与患者的生存之间的关系。我们的数据显示,高表达NFIA蛋白的星形细胞瘤患者其生存期较长,表明NFIA在人脑星形细胞瘤的生物学活动中可能发重要作用。

1材料与方法

1.1组织标本：这项回顾性研究分析了从2007年~2012年间在我院的116例患者病理标本。病理审查后,8例保存不当的肿瘤材料被剔除在外。余下的108例可利用组织样本包括82例人脑胶质瘤（61例星形细胞瘤,17例少突胶质细胞瘤,以及4例少突-星形细胞瘤）,16例非角质细胞肿瘤（听神经瘤、脑膜瘤,神经鞘瘤,淋巴瘤,每组4例）,和10例从癫痫外科手术或尸体解剖切除非肿瘤性脑组织。其中高级别星形细胞瘤25例儿科患者。

1.2免疫组织化学染色：使用免疫组化染色的方法检查NFIA的表达,使用NFIA和GFAP双标记免疫组织化学方法进行。对标本进行石蜡包埋,脱石蜡后,热抗原修复20 min,使用以下抗体：NFIA1:3 000（兔多克隆抗体,）和GFAP1:50（小鼠单克隆的IgG1,DAKO）。NFIA多克隆抗体是针对人NFIA 478-492氨基酸的。一抗使用兔IgG作为阴性对照。根据标准程序,进行苏木精和曙红（HE）染色。

1.3免疫组织化学染色分析：使用Image Pro Plus6.0软件,由同一病理学科医生独立进行盲法分析,按照WHO的诊断分级标准对样品先进行病理诊断。NFIA表达的量化分析由2个研究者独立进行分析。通过计算切片视野中NFIA阳细胞的数量占总细胞数另估比值来确定NFIA的定量表达。（视野倍率×400,每个切片3个视野,至少包含200肿瘤细胞）。NFIA染色细胞作为NFIA-表达细胞。由于内皮细胞缺乏NFIA免疫反应性被用来作为内部背景阴性对照。两个分析者读数的平均值用于统计分析。

1.4PFS：PFS定义为自诊断之日起,最小时间间隔的日期肿瘤的复发,进展或最后的随访。 

1.5数据分析：患者的生存分析采用(Kaplan-Meier)方法,NFIA的表达各组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,使用SPSS16.0进行分析。

2结果

2.1NFIA的在正常大脑星形胶质细胞中的表达：我们采用免疫组化的方法分析正常脑组织表达,确定是否正常人类的星形胶质细胞中也有表达NFIA。结果发现,NFIA在正常的人大脑皮层表达较多（图1-A）,而在白质中表达较少（图1-B）。值得注意的是,NFIA染色的细胞表现星形胶质细胞的特征,与少突胶质细胞比较,具有较大的胞核和丰富的胞浆,NFIA和GFAP的双染细胞（分化的星形胶质细胞标记）显示在正常的大脑皮层,NFIA是主要表达在GFAP阳性细胞上（图1-C）。这些数据表明,在正常的人类大脑皮层,NFIA主要表达在细胞星形胶质细胞谱系。

图1A大脑皮层,B白质C  NFIA (褐色) 和GFAP (猩红色)双染在星形胶质细胞（×400）

2.2NFIA在胶质细胞瘤中的表达：在胚胎发育过程中,NFIA主要表现在星形胶质细胞系的细胞,但少量表达在少突胶质细胞系。因此,比较NFIA在非星形胶质瘤中的表达：61例星形胶质细胞和16例少突胶质细胞瘤和16例非角质细胞作比较。我们发现只有具有星形胶质细胞特征的细胞高表达NFIA（图2-A）。反之,少突胶质细胞不表达NF1A的（图2-B）。NFIA在少突胶质细胞瘤细胞的定量分析表明,平均只有7.25％表达NFIA（。其表达显着低于星形细胞瘤的表达（P<0.01,表1）。同样,在我们观察的非角质脑肿瘤（神经鞘瘤,淋巴瘤和脑膜瘤,共4例其他类型的肿瘤）,NFIA也有3％左右的肿瘤细胞表达（图2-C）。综上所述,这些数据表明,虽然NFIA在星形细胞瘤中高表达,它是在少突胶质细胞瘤和在非角质脑瘤中也有少量表达。

2.3NFIA在恶性星形细胞瘤中的表达与PFS 的关系：我们进一步将NFIA的表达按高低分为相等的三个组,根据患者PFS做了生存分析,结果显示三组的中位生存时间分别是69、41、44个月,P=0.036＜0.05。NFIA高表达组生存率较高与PFS明显的呈单变量复相关（图3）。

3讨论

NFIA是一种在小鼠和鸟类的胚胎发育过程中早表达、决定星形胶质细胞的命运的转录因子。本次研究的目的是评价角质细胞命运的决定因素NFIA在人类神经角质细胞瘤与一般脑肿瘤和非神经胶质细胞瘤中的表达。尽管我们的数据提示NFIA参与星形角质细胞的生物学过程,但是其机制尚未明确。因为NFIA是神经胶质细胞胚胎发育过程中必须的。这是一个基于遗传和细胞背景的复杂作用机制,NFIA的表达的具体作用体现在不同的亚型［12-13］。值得注意的是在鸡的胚胎成纤维细胞NFIA是不致癌的,并且它的表达有助于细胞抗致癌基因引起的细胞分化。比如说jun,fos和myc基因（所有编码转录的因子）［14］,再次说明了其抗癌的作用。但是这些表达NFIA的鸡细胞又容易在胞质中致癌基因作用下分化如src,raf,ras基因,说明它通过不同的信号转导通路扮演着不同角色。发生以上情况的原因可能是很多亚型的不同作用,正如WT1一样最初是在肿瘤抑制基因中发现,但是在另一个亚型里面,后来发现又具有促癌作用［15-16］。另外遗传背景也能发挥重要作用,在确定抗癌/促癌功能方面,这些已得到证明,如myc和ras甚因,它们p53表达时候诱发凋亡,当p53缺失促进转化［17-19］。NFI能在p53启动子位置联合启动p53基本功能的一种锌指蛋白,他能促进如c-myc或抑制如c-fos等其他启动子［20］。

寻找从少突胶质细胞肿瘤区分星形细胞瘤的标记,长期以来一直是神经病理学家和神经肿瘤学家的目标。然而,如Olig2和STAT3,这被认为是作用于神经胶质瘤的形成的标记,都同样表达在星形细胞瘤和少突胶质细胞,限定了他们的诊断价值［21-22］。因此,我们的观察NFIA表达在所有级别的星形细胞瘤,但只有少量表达在少突角质细胞瘤,并估计未来的研究可能会发现NFIA是一个区分这两个神经胶质肿瘤有用的诊断标记。

支持上述说法,少量的少突胶质细胞肿瘤的初步检查显示,细胞NFIA的表达和少突胶质细胞标记的细胞表达,Olig2是相互排斥的（数据未显示,未发表的数据）。NFIA是优先表达在星形胶质细胞,少突胶质细胞与发育阶段的表达模式,这些数据是一致的。有趣的是,在脊髓发育的某些阶段,Olig2对抗NFIA促进星形胶质细胞的分化,并且NFIA对Olig2的抑制似乎依赖于两种蛋白的相对水平。另外,Olig2可以转录抑制NFIA表达。在Olig2 2/2小鼠,有一个脱抑制NFIA表达,这表明在少突胶质细胞Olig2可能转录抑制NFIA表达的。当然还需要更全面的研究,以确定是否NFIA可能是有用的诊断星形胶质细胞的标记,以区分脑星形细胞瘤,少突胶质细胞肿瘤的情况下,尤其是形态学很难评估的时侯。

我们证明NFIA在星形细胞瘤中的蛋白表达与更长的PFS显着相关,尽管这是一个相对较小样本的分析。较大规模的多中心研究将可以确定是否NFIA可能是一个潜在的星形细胞瘤的预后指标。Scrideli等通过实时定量PCR检测20例GBM NFIA mRNA的表达高于10个非肿瘤性样品白质超过13倍,遗憾的是但没有检查其与PFS或OS的关系。

我们的免疫组织化学结果表明,GBM的细胞表达NFIA在分数是高于在正常脑组织,Scrideli等在蛋白质水平证实了NFIA在鸡胚成纤维细胞中的表达,使它们能够抵抗核内癌基因的激活,这个结果可能暗示我们实验结果的相关机制。NFIA在鸡胚成纤维细胞的保护作用说明其可以保护细胞免受进一步转变事件。然而它的损失是暴露细胞使其恶性变的可能性增加。总之,我们的数据表明,星形细胞瘤NFIA蛋白的表达改善PFS有明确的关系。这也支持REMBRANDT GBM芯片分析数据库。这些发现,与现有的知识相结合,表明NFIA可能在星形细胞瘤生物学中具有重要的作用。

同时值得注意的是我们发现在GBM中与非血管周围肿瘤细胞相化NFIA蛋白是高度浓缩在血管周围的肿瘤细胞的浸润性肿瘤边界,这提示我们在星形胶质细胞瘤中,NFIA参与(或促进或抑制)肿瘤细胞做浸润和转移。与此同时,黏附分子ephrin B1和钙粘蛋白也被证实是NFIA的目标［23］。这值得进一步深入研究。