槐耳浸膏对人肝癌高转移细胞系转移的抑制作用研究

作者：李立新,叶胜龙,王艳红

作者单位：复旦大学肝癌研究所，中山医院，上海市肝脏肿瘤临床医学中心，上海 ２０００３２         【摘要】  　　［目的］ 探索槐耳浸膏抑制肝癌细胞转移的机制，为槐耳浸膏在临床上治疗肝肿瘤提供理论依据。［方法］将高转移潜能人肝癌细胞系（MHCC97H）分别与槐耳浸膏（1.0mg/ml，3.0mg/ml，5.0mg/ml，10.0mg/ml）及DMEM（含10%胎牛血清）作用24h，测定其肿瘤细胞黏附率、运动抑制率及侵袭抑制率。［结果］ 各组MHCC97H细胞经槐耳浸膏作用24h后，其细胞黏附率明显下降，而运动抑制率及侵袭抑制率明显上升，与对照组相比差别均有统计学意义，且槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞黏附率、运动抑制率及侵袭抑制率均有相关性。［结论］ 槐耳浸膏能明显抑制肝癌细胞的黏附、运动及侵袭能力，故可以阻抑肝癌细胞的转移。

    【关键词】  槐耳浸膏　肝癌细胞系　转移　抑制

　　Metastatic Potential Inhibited with Trametes Robiniophila in Highly Metastatic PotentialHuman Hepatocellular Carcinoma Cells Lines

    LI Li?xin, YE Sheng?long, WANG Yan?hong, et al.

    (Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Clinical Medicine Centre for Liver Cancer, Shanghai 200032 ,China)

    Abstract:［Purpose］To explore the mechanism of metastatic potential inhibited with Trametes robiniophila in human hepatocellular carcinoma cells andto provide the experimental basis of Trametes robiniophilain treatment for liver cancer. ［Method］ Highly metastatic potential human hepatocellular carcinoma cells (MHCC97H) were treated with DMEM and Trametes robiniophila (1mg/ml,3mg/ml,5mg/ml and 10mg/ml) for 24h respectively.The rates of cells adhesion, cell motion andcells invasion were measured. ［Results］ After MHCC97H cells inculated with Trametes robiniophila for 24h, the rates of cells adhesion decreased and cells motion and cells invasion increased obviously, with significant differences between Trametes robiniophila group and control group.The rates of cells adhesion, cells motion and cells invasion were correlated with concentration of Trametes robiniophila. ［Conclusion］ Trametes robiniophila markedly inhibit the ability of cells adhesion, motion and invasion in highly metastatic potential human hepatocellular carcinoma, so it can arrest the metastasis of cancer cells.

    Key words: Trametes robiniophila; hepatocellular carcinoma cells; metastasis；inhibition

    槐耳是生长在中国古槐树上的一种药用真菌——槐栓菌（Trametes robiniophila Murr），具有“治风”、“破血”、“益力”的功效，民间多用于治疗癌症和炎症。由槐耳菌质经热水提取得到的槐耳浸膏含有多种有机成分和十余种矿物元素，其主要抗癌活性成分为蛋白多糖（PS?T）。动物实验已证实槐耳浸膏具有明显抑制肿瘤生长和延长荷瘤动物生存期的功效，其成品——槐耳颗粒已广泛应用于临床,并有大量报道证明其对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等肿瘤有独特疗效[1]。但其抗癌机制迄今尚未见全面报道，尤其是在抗肝癌转移和复发的基础研究方面所见报道极少。本研究目的即试图通过槐耳浸膏干预肝癌细胞的黏附、运动、侵袭等方面，较为系统地探讨槐耳浸膏抑制肝癌细胞转移的机制，为临床治疗肝癌提供部分理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    MHCC97H肝癌细胞系由复旦大学肝癌研究所建立。采用DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养，每3d更换培养基。0.25%胰酶?EDTA消化液消化后1：3传代。纤连蛋白（fibronectin，Fn）和多聚赖氨酸购自Sigma公司；小牛血清白蛋白（BSA）购自Roche公司；HEPES购自Merck公司。DMEM（Dulbecco Modified Eagle Medium）购自Gibco/Brl 公司；胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自Difco公司。FALCON细胞培养板，培养瓶购自Becton Dickinson公司。Costar Transwell培养板（3422，孔径8.0μm，直径6.5mm）购自Corning公司。姬姆萨染液的组成为姬姆萨色素0.5g加甘油30ml研磨，加甲醇500ml，摇匀溶解。Matrigel Basement Membrane Matrix（356237，Phenol Red?free）购自BD公司。槐耳浸膏由江苏盖天力药业有限公司提供。将槐耳浸膏溶于DMEM（含10%FBS）中，使其溶度分别为1.0mg/ml、3.0mg/ml、5.0mg/ml和10.0mg/ml。0.22μm滤器抽滤待用。缓冲液A的组成为tris?HCl 20mmol/L，pH7.4，氯化钠 150mmol/L，氯化镁 1mmol/L，氯化钙1mmol/L，氯化锰1mmol/L。缓冲液B的组成为tris?HCl 50mmol/L，pH7.4，氯化钠 100mmol/L，氯化镁1mmol/L，氯化钙2mmol/L，氯化锰 1mmol/L。黏附缓冲液B的组成为Hepes 10mmol/L（pH7.4），氯化钠140mmol/L，氯化钾5.4mmol/L，葡萄糖5.56mmol/L，3%BSA，氯化镁1mmol/L，氯化钙2mmol/L，氯化锰1mmol/L。

    1.2 方 法

    1.2.1 体外检测肝癌细胞黏附

    将Fn溶于缓冲液A（10mg/L），每孔加入0.1ml。以100μg/ml多聚赖氨酸和1%BSA包被孔作为最大和最小黏附参照，4℃孵育过夜或自然干燥，用缓冲液B洗板，黏附缓冲液B封阻（30℃，2h），再用缓冲液B加1g/L BSA洗2次。已贴壁MHCC97H细胞与槐耳浸膏（1.0mg/ml，3.0mg/ml，5.0mg/ml，10.0mg/ml）及DMEM（含10%胎牛血清）作用24h，胰酶消化，1000r/min离心2min，弃上清，PBS洗3次。0.1%BSA溶液悬浮MHCC97H细胞并调整为1×106/ml。每孔加入0.1ml细胞悬液，37℃，5%CO2孵育3h。弃培养液，用黏附缓冲液B洗2次以去除未黏附之细胞。用3%多聚甲醛的PBS固定。用0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.5）淋洗1次。加入含1%亚甲蓝的0.1mol/L硼酸缓冲液0.1ml（pH8.5），室温放置20min。弃亚甲蓝，用硼酸缓冲液洗4次。每孔加入1mol/L HCl 0.1ml，37℃，40min。在酶标定量仪上用570nm波长测定光密度值（OD570），计算细胞黏附率。

  细胞黏附率=

    ■×100%

    1.2.2 体外检测肝癌细胞趋化运动

    用无血清DMEM培养液稀释Fn（7.5μg/ml），按每孔50μl均匀涂布于Transwell小室滤膜上表面。紫外线照射4℃孵育过夜，使用前浸于无血清DMEM培养液中，37℃孵育2h待用。

    10%FBS?DMEM培养基常规培养细胞，待细胞铺满培养瓶底后，用无血清DMEM冲洗2次，加0.1%BSA?DMEM培养48h。离心去除细胞收集培养上清为肿瘤细胞趋化因子。过滤除菌，-20℃保存待用。

    已贴壁MHCC97H细胞与槐耳浸膏（1.0mg/ml，3.0mg/ml，5.0mg/ml，10.0mg/ml）及DMEM（含10%胎牛血清）作用24h，胰酶消化，1000r/min离心2min，弃上清，PBS洗3次。0.1%BSA溶液悬浮MHCC97H细胞并调整为1×106/ml。Transwell上室加入细胞悬液100μl（含1×105个细胞），下室加入肿瘤细胞趋化因子600μl，37℃，5%CO2孵育24h。孵育结束后稍稍水洗，用棉签擦去滤膜上表面未穿膜的肿瘤细胞。滤膜甲醇固定30min，姬姆萨染色，将膜固封于载玻片上。200倍显微镜下计数5个不同视野的穿膜细胞数，取平均数，计算运动抑制率。

    运动抑制率=

    ■×100%

    1.2.3 体外检测肝癌细胞侵袭能力

    用无血清DMEM培养液稀释Matrigel 基质（2mg/ml），按每孔50μl均匀涂布于Transwell小室滤膜上表面。余实验步骤同以上趋化运动试验。在200倍显微镜下计数5个不同视野的穿膜细胞数，取平均值，计算侵袭抑制率。

    侵袭抑制率=

    ■×100%

    1.3 统计分析

    采用SPSS 11统计软件包，应用单因素方差Bonferroni法分析整理数据。应用成对检验相关性分析one?tail及成对检验相关性分析two?tail检验槐耳浸膏浓度分别与肿瘤细胞黏附率、运动抑制率、侵袭抑制率之间的相关性。

    2 结 果

    2.1 槐耳浸膏对细胞黏附能力影响

    MHCC97H细胞与纤连蛋白之间黏附力强，空白对照组细胞黏附率为75.56±1.343%。经过槐耳浸膏作用24h后，细胞黏附能力明显下降（图1）。各槐耳浸膏组细胞黏附率分别为：1mg/ml组66.44%±1.381%, 3mg/ml 49.23%±2.067%, 5mg/ml组36.66%±1.892%, 10mg/ml组30.12%±1.741%。各组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。应用成对检验相关性分析one?tail及成对检验相关性分析two?tail检验槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞黏附率成负相关，相关系数分别为-0.9（P<0.01）和-0.914（P<0.01）。

    2.2 槐耳浸膏对细胞趋动的影响

    MHCC97H细胞运动能力较强，对照组穿膜细胞数为49.64±3.189/200倍视野。经过槐耳浸膏作用24h后，运动能力明显下降，显示出较明显的运动抑制力(图2)。各槐耳浸膏组细胞运动抑制率分别为：1mg/ml组28.78%±4.986%，3mg/ml组60.41%±2.469%，5mg/ml组75.36%±2.863%，10mg/ml组83.49%±2.672%。各组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）。应用成对检验相关性分析one?tail及成对检验相关性分析two?tail检验槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞趋化运动抑制率成正相关，相关系数分别为0.863（P<0.01）和0.977（P<0.01）。

    2.3 槐耳浸膏对细胞侵袭运动的影响

    MHCC97H细胞侵袭力强，对照组穿膜细胞数36.68±3.695/200倍视野。经过槐耳浸膏作用24h后，侵袭力下降，显示出较明显的侵袭抑制作用（图3）。各槐耳浸膏组细胞侵袭抑制率分别为：1mg/ml组43.70%±5.497%，3mg/ml组60.33%±8.290%，5mg/ml组83.25%±3.500%，10mg/ml组86.03%±4.040%。各组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）。应用成对检验相关性分析one?tail及成对检验相关性分析two?tail检验槐耳浸膏浓度与MHCC97H细胞侵袭抑制率成正相关，相关系数分别为0.814（P<0.01）和0.942（P<0.01）。

    3 讨 论

    恶性肿瘤细胞的转移过程包括肿瘤细胞黏附（adhension），细胞外基质（extricellular matrix，ECM）降解，细胞移行（migration）三种基本现象[1~3]。肿瘤细胞之间及其与正常组织、细胞之间的黏附状态异常是肿瘤细胞侵袭的始动环节，它涉及多个黏附及去黏附过程。黏附过程包括：肿瘤细胞与内皮细胞，内皮下基底膜及转移灶宿主细胞的黏附。去黏附过程包括肿瘤细胞之间的去黏附及其离开基底膜和内皮细胞。黏附和去黏附过程的不断交替是其侵袭的关键[4，5]。另外恶性肿瘤细胞在侵袭过程中需要不断分泌各种蛋白酶来降解细胞外基质和基底膜，其中基质金属蛋白酶（如MMP?2，MMP?9等）在这一过程中起着重要作用。肿瘤细胞正是依靠这些蛋白酶来不断降解细胞外基质和基底膜，并通过自身的伪足运动，以及前述的黏附和去黏附过程来发生侵袭和转移。因此，要控制肿瘤细胞的侵袭和转移，就必须抑制肿瘤细胞与基质或基底膜或宿主细胞的黏附及其对基质或基底膜的降解以及自身的运动。

    Fn为基底膜和细胞外基质的重要成分。肿瘤细胞从母体脱落后，侵袭基底膜和细胞外基质，通过膜表面受体可黏附于Fn上而产生运动和迁移，使肿瘤扩散和转移。

    MHCC97H细胞是由复旦大学肝癌研究所建立的高转移潜能人肝癌细胞株[6]。它体外侵袭力强，接种裸鼠后肺转移率为100%。本次实验采用了该细胞株来检测槐耳浸膏对肿瘤细胞黏附、运动、侵袭能力的影响。结果提示：①经槐耳浸膏作用的MHCC97H细胞的粘附率明显下降，两者之间存在剂量效应相关性。细胞黏附率随槐耳浸膏浓度的增加而下降，至10mg/ml时细胞黏附率较对照组下降60.14%。②经槐耳浸膏作用的MHCC97H细胞的运动、侵袭能力明显下降，且细胞运动抑制率、侵袭抑制率与槐耳浸膏浓度均呈正相关。

    从以上实验结果，我们可以看到槐耳浸膏对MHCC97H细胞的黏附、运动、侵袭能力均有明显的抑制作用，从而阻抑肿瘤细胞的转移为临床上槐耳浸膏防治肝癌的转移提供了理论依据。

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