低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究

作者：陈公英,李敏伟,陈智

作者单位：1.杭州市第六人民医院，浙江 杭州 310014;2.浙江大学附属第一医院传染病研究所，浙江 杭州 310003       【摘要】  　　［目的］ 研究低分子肝素（LMWH）抗肝癌细胞SMMC-7721增殖作用及机制。［方法］ MTT法测LMWH、UFH及联合化疗药物阿霉素(ADR)对SMMC-7721的生长抑制作用，流式细胞仪Annexin V FITC-PI法检测细胞凋亡发生率，同时Western blot检测细胞p53、bcl-2蛋白表达。［结果］ LMWH、UFH能抑制细胞生长，呈剂量依赖关系，并与诱导细胞凋亡有关；化疗药物ADR联合肝素有协同抗增殖作用。LMWH、UFH促进细胞凋亡过程中，p53表达无明显改变，bcl-2表达略下调。［结论］ 肝素、低分子肝素可通过诱导细胞凋亡发挥抗肝癌作用；化疗药物ADR联合肝素有协同抗增殖作用。

    【关键词】  低分子肝素　流式细胞术　凋亡　阿霉素　肝癌细胞

    肝素（高硫酸化葡萄胺聚糖）是一种重要的抗凝药物。除了抗凝活性以外，近来发现其具有抗肿瘤、抗炎症 、抗病毒等生物学作用，特别是抗肿瘤作用更受学者关注。近年发展起来的一种生化药物低分子量肝素，减少了由完整肝素带来的出血和血小板减少等副作用[1]，因而用于治疗某些恶性肿瘤效果好且安全。本文主要研究低分子肝素抗肝癌细胞SMMC?鄄7721的增殖作用及机制。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    肝素钠注射液，12 500U/2ml (南京新天生物有限公司)；低分子量肝素钠，4 250IU/0.4ml（意大利ALFA WASSERMANN S.P.A大药厂）；MTT（Sigma公司） ； ANNEXIN V?鄄PI检测试剂盒（美国CALTAG 公司）；鼠抗人p53、bcl?鄄2 单克隆抗体（DAKO公司）； biotinylated protein ladder detection pack(cell signaling 公司)；肝癌细胞株SMMC?鄄7721购于中科院上海细胞生物所。主要仪器：免疫学标本制备仪（EPICS?鄄Q?鄄PREP型，美国Coulter公司产品），流式细胞仪（EPICS?鄄XL型，美国Coulter公司产品）。

    1.2 方 法

    1.2.1 细胞培养

    肝癌细胞株SMMC?鄄7721采用含10%（V/V）的小牛血清、300μg/ml L?鄄谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和25μg/ml链霉素的RPIM1640（GIBCO BL）培养基、在37℃、5%CO2 及饱和湿度的条件下培养。

    1.2.2 细胞增殖抑制试验

    按文献方法[1]将对数生长期细胞按2×104（100μl）/孔接种于96孔板，用含10%的小牛血清的培养基100μl培养24h，去掉培养基，加入用完全培养基配制的不同浓度两种肝素（0～100U/ml），并选择合适剂量25U/ml、50U/ml肝素加入亚毒性剂量的阿霉素，用完全培养基加至100μl；同时设空白对照，每个浓度均设3个复孔。培养48h后，每孔加入20μl(5mg/ml)MTT，孵育4h。倾去上清液，加入二甲亚砜150μl/孔，于酶标仪上读取A570nm值，计算细胞生长抑制率=[（1-实验组吸光值/对照组吸光值）]×100%，得出量效关系曲线。

    1.2.3 凋亡检测

    将细胞以105/ml接种于24孔。用含有10%的小牛血清的培养基1ml培养24 h后倾去培养液，加入含合适剂量肝素的完全培养基1ml，培养48h,以不用肝素处理的细胞作阴性对照。采用流式细胞术检测Annexin V和碘化丙啶（PI）荧光标记细胞凋亡值。操作严格按试剂盒说明书进行。结果以Annexin V染色阳性，PI染色阴性判定。

    1.2.4 Western blot 分析

    采用细胞裂解缓冲液(25mmol/L Hepes，1.5%Triton X?鄄100，1%去氧胆酸钠，0.1%SDS，0.5mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，50mmol/L NaF，1mmol/L PMSF，0.1g/L Leupeptin) (pH7.8) 4℃ 30min裂解细胞。15 000g 离心15min，取上清液。用Bradford法进行蛋白定量。加上样缓冲液(42mmol/L Tris?鄄HCl，10% 甘油, 2.3% SDS，5% 2?鄄巯基乙醇、0.002% 溴芬蓝) 煮沸3min后，10%SDS?鄄PAGE电泳、转移到PVDF膜，anti?鄄bcl?鄄2、p53一抗4℃孵育过夜，与标有HRP二抗结合，化学发光剂ECL显影。

    1.3 统计分析

    实验数据以平均值表示，采用SPSS10.0统计软件，进行独立样本t检验及直线相关分析。

    2 结 果

    2.1 肝素对肝癌细胞增殖的抑制作用

    肝癌细胞SMMC?鄄7721在分别与不同剂量100U/ml、50U/ml、25U/ml、12.5U/ml的肝素培养48h进行后，其对细胞生长的抑制率分别为，肝素组17.8%、13.9%、13.7%、11.7%；低分子量肝素组31.7%、24.4%、16.6%、15.11%。相同浓度的两种肝素，LMWH抗癌作用明显高于肝素（t=1.89，P<0.05）;细胞增殖呈肝素浓度依赖关系（R=0.973，P<0.05），见图1。

    2.2 肝素联合阿霉素对肝癌细胞增殖的协同抑制作用

    SMMC?鄄7721细胞在与50U/ml浓度的肝素及亚毒性剂量的阿霉素（0.25μg/ml）共同培养48h后，进行MTT试验，其结果如图2所示。ADR（0.25μg/ml）抑制率10.2%、肝素14.4%、肝素+ADR 31.4%、LMWH 32.9%、LMWH+ADR 45.9%。两种肝素联合阿霉素对肝癌细胞增殖有显著的协同抑制作用（t1=3.21，P<0.05；t2=2.35，P<0.05）。

    2.3 肝素诱导肝癌细胞凋亡的作用

    不同浓度的两种肝素处理SMMC?鄄7721细胞48h凋亡细胞明显增加。详见表1、图3。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylscrine，PS)分布于细胞膜内，细胞发生凋亡的早期便从膜内翻转至膜外。Annexin V在Ca＋＋存在时可以和PS特异结合。

    2.4 肝素作用SMMC?鄄7721 p53，bcl?鄄2表达改变

    在使用肝素处理SMMC?鄄7721细胞后，两种肝素两种剂量对p53基因表达无显著性影响，bcl?鄄2表达略降低，见图3。

    3 讨 论

    肿瘤患者往往伴发高凝血症及血管栓塞，有资料显示癌症合并静脉血栓患者，肝素的使用明显改善了患者的生存[3]。本文研究结果也进一步证明肝素抗肝癌细胞增殖的作用，故推测肝素可能有直接的抗癌作用。

    以往的研究发现肝素的抗肿瘤作用涉及到抑制肿瘤形成、癌细胞生长及转移各个环节，在这些环节中肝素与其他物质相互作用，扮演着重要的角色[4，5]，如：①抗凝，②免疫调节，③抑制细胞黏附，④抑制肝素酶活性，⑤抑制新生血管增生，⑥非特异性竞争结合促肿瘤生长因子。

有文献报道肝素可诱导鼻咽癌细胞CNE2凋亡而发挥抗癌作用[6]，可否直接诱导肝癌细胞凋亡？国内程数群等[7]动物实验发现肝素、可的松有较强的抑制肝癌细胞生长的作用，抑瘤率达86%；郑起等[8，9]在肝癌转移模型中也有相关报道，但具体机制不很清楚。本实验结果显示肝素、低分子肝素均有显著性诱导肝癌细胞凋亡作用；并与bcl?鄄2蛋白表达下调等有关。凋亡抑制基因bcl?鄄2能抑制多种凋亡信号引起的细胞凋亡，其表达产物主要定位于线粒体外膜，参与在线粒体膜上形成离子传导途径。当bcl?鄄2过量表达时，可干扰传导途径的形成，抑制凋亡；bcl?鄄2表达降低后，可能改变对线粒体的调控，导致凋亡相关活性物质释放，激活caspase酶系而促进凋亡。

    两种肝素抗增殖作用的比较研究对临床开展肝素抗肿瘤治疗有重要指导作用。低分子肝素药代动力学较普通肝素有显著改进，半衰期延长后使临床应用的适应证扩大。普通长链肝素非特异性结合凝血因子如vWF可引起出血；与PF4结合形成复合物，在体内产生抗体，引起免疫性Ⅱ型血小板减少症。本研究显示低分子肝素对肝癌细胞SMMC?鄄7721不但保留甚至超过了普通肝素的抗肿瘤效果，在抗肿瘤方面较普通肝素更为有效并且安全。

    化疗是目前肝癌治疗的一种重要手段，但其非特异性的毒副作用和耐药性给临床增加了治疗难度。本研究显示肝素联合阿霉素有显著的协同作用，ADR（0.25μg/ml）联合肝素后抑制率从10.2%提高到31.4%；联合LMWH，抑制率从10.2%提高到45.9%。肝素与ADR的协同作用可以大大减少化疗药物剂量，减少化疗带来的一系列并发症，有望提高患者的生存质量。肝素作为一新的抗肿瘤药物将具有重要的意义。

【参考文献】  [1] Denizot F,Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability[J]. J Immunol Methods, 1986,89(2):271-277.

[2] McCrae KR, Bussel JB, Mannucci PM, et al. Platelets: an update on diagnosis and management of thrombocytopenic disorders[J]. Am Soc Hematol Educ Prog, 2001,282-305.

[3] Bereczky B, Gilly R, Raso E, et al. Selective antimetastatic effect of heparins in preclinical human melanoma models is based on inhibition of migration and microvascular arrest[J]. Clin Exp Metastasis, 2005,22(1):69-76.

[4] Fritzsche J, Hunerbein I, Schumacher G, et al. In vitro investigation on the selectin binding mechanisms in tumor cell metastasis and their inhibition by heparin[J]. Int J Clin Phamacol Ther, 2005, 43(12):570-572.

[5] Ram S, Zachary S, Ganesh V. Roles of heparin?鄄sulphate glysosaminoglycans[J]. Nature Reviews Cancer, 2002,2: 521-528.

[6] Li HL,Ye KH,Zhang HW,et al. Effect of heparin on apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells[J]. Cell Research, 2001, 11(4):311-315.

[7] 周信达，汤钊猷，余耀. 高功率聚焦超声联合肝素可的松治疗肝癌的实验研究[J]. 中华消化杂志, 1999, 19 （1）：10-12.

[8] 郑起，汤钊猷，薛群. 肝素在肝癌裸鼠转移模型中对肿瘤生长转移的影响[J]. 中华肝脏病杂志, 1998,6（3）：151-152.

[9] 闫钧，郑起，汪昱，等. 达肝素对肝癌转移抑制的实验研究[J]. 中华肝脏病杂志, 2005,13（5）：359-361.