实时定量大肠癌组织中MK基因表达及其临床意义

　　作者：李克强,陈功星,张佳炜,曹树立,胡锡浩　　作者单位：浙江省宁波市第二医院肿瘤二科 杭州师范大学医学实验中心 浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所 浙江省宁波市第二医院烧伤科

　　【摘要】 目的 利用实时定量PCR(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)相对定量大肠癌组织中Midkine(MK)基因的表达，探讨MK基因在大肠癌不同病理状态中的意义。方法 提取34例临床大肠癌组织及其癌旁正常组织中的总RNA，经寡聚脱氧胸腺嘧啶逆转录，RT-PCR扩增，以内标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的mRNA相对定量MK基因的mRNA表达，比较癌组织与其癌旁正常组织中的MK表达差异。结果 34例样本中癌组织较之癌旁正常组织，MK基因表达降低(P<0.01);其中在Ducks分期中C期、女性组、淋巴结转移、管状腺癌和浸润浆膜层组中癌组织较之癌旁正常组织表达降低(P<0.05)，其余组大肠癌组织较之癌旁正常组织无统计学意义(P>0.05)。结论 在大肠癌病程晚期癌组织中MK基因的表达水平降低。

　　【关键词】 实时定量 PCR Midkine基因

　　【Abstract】 Objective With Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Midkine (MK) gene expression was relatively quantified in colorectal cancer samples. We discussed a relationship of MK expression and colorectal cancer. Methods The total RNA was extracted from 34 clinical samples of colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. The RNA was reverse transcripted into cDNA with oligodT. And the cDNA was amplified by RT-PCR. MK relative expression was quantified to an inherence gene Glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH). At last the different was analyzed between colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. Result In the 34 samples MK mRNA of the colorectal cancerous tissue is less than that of the adjacent normal tissue (P<0.01). And the same situation is MK mRNA in the14 C-phase samples, the female, the transferred lymphaden, the tubular adenocarcinoma and the invasive subserous groups (P<0.05). But there is no statistical signification (P>0.05)in the other groups. Conclusion MK expresses lowly in the colorectal cancer of late stage.

　　【Key words】 Real-time Quantitative PCR Midkine gene

　　大肠癌在我国近几年发病率上升，5年生存率在60%左右，但治疗效果30年来无显著提高[1]。大肠癌发生机制相对于其它肿瘤的发生机制来说较为清楚，但仍有很多问题尚未解决，特别是早期发生阶段的机制还不清楚,应用基因分析手段检测相关基因的异常变化有可能在早期诊断和预后判断上发挥作用[2]。Midkine(MK)基因是日本学者Kadomatsu等[3]运用差异杂交的方法，从视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤HM-1细胞株cDNA文库中筛选出的一个新基因，在多种肿瘤患者血清中高表达[4]，尤其是在肝癌组织中的表达，肝癌组织恶化时表达增加，肝癌组织恶性程度低时表达少[5]，此外，MK基因在早期大肠癌变组织中也是表达升高的[6]，但晚期的表达未见报道，作者自2006年5月至2007年12月利用实时定量PCR(RT-PCR)技术，对临床大肠癌样本进行分析，观察MK基因在大肠癌组织及其癌旁正常组织中的表达情况，进一步探讨MK基因表达mRNA水平与大肠癌病理过程的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 样本的采集 34例大肠癌及其癌旁正常组织标本随机取自浙江大学医学院附属第二医院肿瘤外科、普通外科手术患者，其中男17例，女17例;年龄25～84岁，平均62.1岁，经病理检查确定。

　　1.2 试剂和仪器 引物设计为跨目的基因内含子、含两个外显子部分碱基的序列，并经blastn基因库搜索，符合引物常规设计要求，荧光素标记为PCR仪器所要求：MK基因上游引物：5'-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3'，下游引物：5'- CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3'，探针：5'-FAM CCAGGAGACCATCCGCGTCACC TRMAR-3'(上海生物工程公司合成)，含甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因上、下游引物和VIC标记探针的20×Human GAPDH、2×PCR master mix、dNTPs购于PE公司。Trizol、5×Strand buffer、0.1M DTT、SSTRⅡ为GIBCO产品，OligodT由上海生物工程公司合成。主要设备RT-PCR反应仪7700 Sequence Detector ABI PRISM(PE公司)。

　　1.3 总RNA提取 分别取手术后离体大肠癌组织、癌旁正常组织各约100mg，在液氮环境下捣碎并研磨成粉，迅速置于1.5ml的eppendorf 管中，加1ml的Trizol液，反复吹打约10min，加0.2ml氯仿，用力振荡混匀，冰浴10min后, 低温12000g离心15min，吸取上清液置另一eppendorf 管中，加0.5ml异丙醇混匀，室温沉淀10min， 12000g离心10min, 弃上清液,沉淀加75%乙醇1ml洗涤1次，待酒精挥发干后溶于适量0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，-20℃保藏备用。

　　1.4 逆转录cDNA 取10μl的RNA，加入1μl的50μM OligodT，70℃变性10min，立即置冰上2min，离心。然后加入9μl混合试剂：4μl 5×Strand bufer、2μl 0.1M DTT、1μl dN(A,T,C,G)TP、1μl RNase inhibitor、0.5μl SSTR2、0.5μl 1%的DEPC水，在42℃水浴52min，然后70℃水浴15min终止反应，加80μl水混匀置-20℃冰箱保存。

　　1.5 RT-PCR 50μl反应体系中分别含有MK基因上、下游引物各0.3μM、探针0.2μM;2.5μl 20×Human GAPDH、25μl 2×PCR master mix、10μl cDNA。然后在定量PCR反应仪上进行检测，反应条件为：50℃预变性2min;95℃变性10min;95℃变性30s;60℃退火1min，扩增40个循环。在指数期内采集，根据仪器使用指南及实际情况，设定参数值，得到每个PCR反应的CT(Cycle Threshold)值，即模板cDNA经PCR扩增达到某一荧光强度的循环次数。

　　1.6 统计学分析 MK表达的mRNA是以同一组织中内标GAPDH的表达为标准，参照文献[7]进行数据的计算转换，得到的相对GAPDH校正值，一式三份用均数与标准差(x±SD)表示，根据样本来源，及临床患者不同生理病理特征，参照相关文献报道[8]分别列成6个大组，又在每组中再分成不同特征的小组，对癌组织和癌旁组织之间，用SPSS(13.0版)软件进行处理，统计学分析使用t检验。

　　计算公式：

　　cDNAMK×2CT　MK=cDNAGAPDH×2CT GAPDH

　　cDNAMK=cDNAGAPDH×2△CT(△CT =CT GAPDH-CT MK) [cDNAMK表示MK基因的cDNA量，cDNAGAPDH表示GAPDH基因的cDNA量，CT GAPDH(或CT GAPDH)以及CT MK(或CT MK)表示cDNA经PCR扩增到指数期时一定量的理想循环数。]

　　2 结果

　　本实验中实时定量PCR(RT-PCR)检测的基因，是电脑监控下的每个样本基因DNA逐步倍增变化的整个过程(图1)，以每次PCR循环结束后荧光的强度代表基因的产量，在图中为曲线链接的点，每种基因在一个图中显示，每条曲线代表一个样本中检测基因DNA在整个PCR过程中倍增量的变化，样本中基因DNA含量以在图中的位置表现，样本基因DNA含量越少，曲线逐渐右移。在指

　　图1 cDNA聚合酶链反应倍增全过程

　　注：A、B分别为样本中GAPDH基因与MK基因表达mRNA，逆转录cDNA聚合酶链反应倍增全过程。横轴为Cycle，即PCR循环数，每一单位表示一次PCR循环，纵轴为荧光强度的对数值(△Rn)，即每次PCR循环后当时的所有荧光强度与本底的差值，每一条曲线表示一个样本中单一基因PCR反应的全过程，整个曲线变化与普通PCR变化过程相同，有三个区域，依次为基数期、指数期和平台期。

　　表1 大肠癌组织及其癌旁正常组织中MK基因表达的mRNA

　　组别nmRNA水平(x±SD)癌组织癌旁正常组织※P值年龄(岁) ≤4040.06±0.040.33±0.220.10 41～64100.11±0.20.21±0.190.13 ≥65200.12±0.160.21±0.180.07性别 男170.15±0.210.2±0.180.40 女170.06±0.090.25±0.190.00病理类型 乳头状腺瘤50.15±0.260.26±0.170.44 管状腺癌200.13±0.170.24±0.20.02 黏液腺癌30.05±0.060.18±0.230.48 其它类型50.04±0.020.15±0.150.15 #混合型10.010.07淋巴结转移 阴性180.12±0.170.21±0.190.06 阳性160.1±0.160.24±0.190.02浸润程度 黏膜下层10.040.27 肌层90.24±0.260.3±0.220.57 浆膜层240.06±0.080.19±0.170.00Ducks'分期 A40.18±0.270.3±0.150.41 B140.1±0.140.18±0.20.11 C140.09±0.160.25±0.190.02 D20.15±0.210.15±0.21合计340.11±0.160.22±0.190.00

　　注：※P值为该组癌组织与癌旁正常组织两类样本中MK表达mRNA水平的t检验，#混合型是指病理观察中同时存在2种或>2种病理类型的癌组织

　　数期内采集原始数据经内标校正，每个样本中癌组织及其癌旁组织相对定量MK的表达的mRNA水平，根据样本来源的不同生理病理特征分组(表1)。年龄组中分为青、中、老三小组，癌组织较之癌旁正常组织中MK表达无统计学意义(P>0.05);病理类型中管状腺癌、淋巴结转移阳性及Dukes'分期中C期中MK表达，癌组织低于其癌旁正常组织(P<0.05);而性别中女性患者组、肿瘤浸润至浆膜层组及总体样本中，癌组织明显低于其癌旁正常组织MK表达(P<0.01)。此外，由于样本收集的不足，病理类型中的混合类型、浸润黏膜层和与Dukes'分期D期不能进行统计学分析。其余组中癌组织较之癌旁正常组织中的MK表达值均无统计学差异(P>0.05)。

　　3 讨论

　　实时定量PCR(RT-PCR)，通过测试mRNA逆转录后cDNA的含量，从而定量分析基因表达情况，其高通量、简捷在基因研究与应用的许多方面具有重要作用[9]，也是临床诊断分析的一个手段。由于实时定量PCR的直观效果，检测者可直接监控检测过程的全过程(图1)，避开PCR反映过程中表现不合实际的基数期和平台期，及由于仪器设备客观原因出现的错误，从指数期中采集到理想数据。RT-PCR使用的参照标准有外标和内标2种，作者是以同一样本中的GAPDH为内标，在同一反应管中同时检测目的基因和内标基因的表达，以此内标相对定量本样本中目的基因MK的表达，客观又简便。此外，本组样本，每个患者均同时采集癌组织及其癌旁正常组织，检测两份样本，统计分析的是同一患者样本中癌组织与其癌旁正常组织中MK基因的表达，可客观反映异常组织基因表达的实际情况。使用该方法，分析了34例大肠癌临床样本癌组织及其癌旁正常组织MK基因的表达，从收集的样本分布看(表1)，在Dukes'分期组中大部分是B、C期，加上D期的2例，中、晚期样本占大多数，这符合中国的国情，中国患者早期预防不充分，至出现不适症状后就医，大多数患者已至中、晚期，临床上随机收集的样本也体现了这一特色。本研究表明总体样本癌组织较与癌旁正常组织中的MK表达水平降低(P<0.01)，这与Ye等[6]报道的MK表达情况不一致，该文分析了20例大肠癌前期病变的腺瘤组织中，MK基因表达升高。本资料34例样本不同生理病理分组体现早期特征的样本中，病理分类组中乳头状腺瘤5例，浸润程度组中黏膜下层1例，Ducks'分期组中A期4例，均占总体样本的少部分，其中可统计分析的小组中，癌组织较之癌旁正常组织无显著性差异(P>0.05),推测可能由于样本数量的原因，尚须进一步加大样本量进行分析来反映国人这方面的情况。但不同病理特征分组中体现大肠癌晚期癌特征的小组样本，占总体样本的大部分，其中淋巴结转移组中阳性、浸润程度组中深层组织浆膜层及Dukes'分期组中C期等小组样本中，MK基因的表达癌组织较为癌旁正常组织降低(P<0.05)，与总体样本反应的结果一致，表明大肠癌晚期的MK基因表达是降低的，这为大肠癌的临床诊治和研究提供参考。至于MK基因表达在女性组中的差异(P<0.01)，尚待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 郑树.大肠癌防治现场研究.中国肿瘤,2005,l4(6):352～354.

　　2 殿春.大肠癌分子生物学研究进展.中国实用内科杂志，2006.26(24)：924～1927.

　　3 Kadomatsu K, Tomomura M, Muramatsu T. cDNA cloning and sequencing of a new gene intensity expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis. Biochem Biophys Res Commun, 1988,151:1312～1318.

　　4 Ikematsu S, Yano A, Aridome K, et al. Serum midkine levels are increased in patients with various types of carcinomas. Brit J Cancer, 2000, 83:701～706.

　　5 Kato M, Shinozawa T, Kato S, et al. Increased Midkine Expression in Hepatocellular Carcinoma. Arch Pathol Lab Med,2000,124:848～852.

　　6 Ye C, Qi M, Fan QW, et al. Expression of midkine in the early stage of carcinogenesis in human colorectal cancer. Br J Cancer, 1999,79(1):179～184.

　　7 陈功星,张佳炜，董庆华，等.实时定量PCR法检测细胞株ST13基因表达.国外医学生物化学与临床检验学分册，2004,25(4):301～305.

　　8 赵强，马胜林，冯建国，等.荧光定量RT-PCR检测肺癌外周血CK19、CK20mRNA表达. 浙江临床医学,2006,8(8):790～791.

　　9 Ginzinger DG. Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol, 2002,30:503～512.