TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究

　　作者：马亚军1,张艳丽1,崔柳1,李秀萍2　　作者单位：1.宁夏医科大学;　2.宁夏医科大学总医院

　　【摘要】 目的　观察TLR9在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法　运用Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC803 TLR9的表达;用不同浓度的TLR9激动剂CpG ODN(2、5、10μg?mL-1)分别作用于胃癌细胞系MGC803不同时间(24、48、72h)后，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长抑制率;免疫组化SP法检测30例胃癌组织和15例癌旁组织中TLR9的表达，并分析其与患者临床病理特征的关系。结果　Western-blot法检测到TLR9在胃癌细胞系MGC803中有表达;2μg?mL-1和5μg?mL-1 CpG ODN仅在作用的72h有抑制胃癌细胞增殖的作用(P<0.01)，而10μg?mL-1 CpG ODN作用24、48h和72h均能显著抑制该细胞的增殖(P<0.01);免疫组化结果显示，在胃癌组织和癌旁组织中均有TLR9的表达，且癌旁组织TLR9的表达高于胃癌组织(P<0.05);高、中分化组TLR9的表达高于低分化组(P<0.05);未观察到TLR9蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、TNM分期和淋巴结转移具有相关性。结论　TLR9在胃癌中有表达，且与肿瘤分化程度有关。

　　【关键词】 CpG ODN;TLR9;胃癌

　　胃癌具有发生率高、侵袭性强的特点，胃癌细胞的生物学行为与临床病理变化有一定的关系，但其中涉及的分子机制仍不清楚[1]。Toll样受体(Toll-like receptors， TLRs)在识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)中起重要作用。大量研究已证实，TLRs在肿瘤发生、发展过程中既可能促进肿瘤生长也可能发生抗肿瘤效应，并且TLRs的表达与肿瘤的某些临床病理特征有相关性，如淋巴转移、肿瘤分期、分化程度等。TLR9是否参与胃癌发生发展过程，目前尚不清楚。本研究以胃癌细胞系MGC803、胃癌组织及癌旁组织为研究对象，观察TLR9在胃癌的表达情况及其与胃癌临床病理特征的相关性。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　MGC803细胞为本室保存;RPMI1640培养基购自GBICO公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amresco公司;胎牛血清购自民海生物公司;TLR9激动剂CpG ODN 1826(5'-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3' ，全程硫代修饰)由北京赛百盛生物基因技术有限公司合成;胃癌组织和癌旁组织均由宁夏医科大学总医院病理科提供;TLR9抗体购自abcam公司;SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC803 TLR9的表达

　　培养细胞达到80%～90%以上的融合状态时，改用含2%胎牛血清的RPMI1640培养。提取肿瘤细胞总蛋白行BCA定量，取40 μg上样 ，SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF 膜在60V,300mA,4°C 恒流条件下转膜3 h,5%脱脂奶粉4°C 封闭过夜，TBST 洗3 次，鼠抗人TLR9 单克隆抗体1∶100 的工作浓度下37°C 孵育3h，TBST 洗3次后用羊抗鼠二抗1∶100 工作浓度下37°C 孵育2h后仍用TBST 洗涤，DAB 显色，ECL发光及曝光， 将胶片进行拍照。

　　1.2.2　MTT法检测细胞增殖活性

　　按常规方法用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中对胃癌细胞MGC803进行培养。选取处于对数生长期且细胞活性大于 98 %的细胞进行实验。调整细胞浓度为2×107/L加入96孔培养板。实验分为四组，细胞对照组;加药组①：2 μg?mL-1的CpG ODN组;加药组②：5μg?mL-1的CpG ODN组;加药组③：10 μg?mL-1的CpG ODN组，每组各设3个复孔。分别作用24、48 h和72 h后，终止培养，每孔加入终浓度5 μg?mL-1的MTT 10 μL,37℃孵育3h后，在酶标仪上测定450 nm 波长下各孔A值。

　　1.2.3　免疫组化SP法检测胃癌组织和癌旁组织TLR9的表达

　　操作严格按SP试剂盒说明书进行。结果判断：TLR9以细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性。400倍光镜下每张切片随机取10个高倍视野阳性细胞百分率，最后取两位病理学专家计算百分率的平均值。以TLR9表达阳性细胞率≥10%为阳性(+)，≥75%为强阳性(++)，<10%为阴性(-)。

　　1.3　统计学方法

　　全部数据采用SPSS 11.5处理，计数资料以百分率表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法;计量资料的组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　TLR9在胃癌细胞MGC803的表达

　　Western-blot法测定结果显示胃癌细胞MGC803中有TLR9的表达，见图1。图1　Western-blot法检测TLR9的表达

　　2.2　CpG ODN对MGC 803 细胞生长的抑制作用

　　2 μg?mL-1和5 μg?mL-1 CpG ODN仅在作用的72 h有抑制MGC803细胞增殖的作用;而10 μg?mL-1 CpG ODN在作用MGC803细胞24、48h和72h均能显著抑制该细胞的生长，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。表1　CpG ODN对MGC803细胞增殖活性的影响

　　2.3　TLR9在胃癌组织和癌旁组织的表达

　　TLR9在胃癌组织和癌旁组织中均有表达，胃癌组织TLR9表达阳性率明显低于癌旁组织 (P<0.05)，见图2(封2)和表2。在临床病理特征方面，年龄≥60岁12例，<60岁18例;男16例，女14例;贲门、胃大弯侧12例，胃窦、胃小弯18例;肿瘤≥5cm 17例，<5cm 13例;有转移19例，无转移11例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期19例。TLR9表达阳性率依次为50%(6/12)、27.8%(5/18);43.8%(7/16)、28.7%(4/14);50%(6/12)、27.8%(5/18);29.4%(5/17)、46.2%(6/13);31.6%(6/19)、45.5%(5/11);54.5%(6/11)、26.3%(5/19)，以上结果差异均无统计学意义(P>0.05)。而在胃癌的分化程度中，高、中分化20例TLR9表达阳性率50%(10/20)，低分化10例表达阳性率10%(1/10)，差异有统计学意义(P<0.05)。表2　TLR9在胃癌组织和癌旁免疫组化结果

　　3　讨论

　　在前期研究中，用RT-PCR法检测出胃癌细胞MGC803中有TLR9 mRNA的表达，其激动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用[2]。本次试验用Western-blot法同样检测出MGC803中有TLR9蛋白的表达，并且发现CpG ODN作用MGC803细胞72 h对其增殖活性的抑制作用呈浓度依赖性。对胃癌组织和癌旁组织行免疫组化检测发现，TLR9在胃癌组织和癌旁组织中均有表达。在胃癌组织中，高、中分化组的阳性表达率明显高于低分化组。且随着胃癌分化程度的增高，TLR9的阳性表达率及表达强度均升高，提示TLR9表达降低者，其恶性程度高，这对辅助判定肿瘤的恶性度有一定价值。在某些肿瘤中已有类似发现，Schmausser等人在正常胃黏膜上皮中检测到TLR9的表达，但在癌前病变包括胃黏膜肠上皮化生和胃异型增生中TLR9的表达缺如[3]。

　　根据TLR9的激动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用，可以考虑将CpG ODN作为靶向药物用于胃癌患者的免疫治疗或辅助治疗，这一点还需在动物实验中进一步验证，其具体的抗肿瘤机制也需要进一步明确。目前，TLR9及其激动剂应用的研究在一些肿瘤中已进入抗肿瘤临床试验阶段[4]，如乳腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、基底细胞癌等。

　　肿瘤是多种因素导致的疾病，TLRs 是固有免疫模式识别的主要受体，通过对PAMPs 进行模式识别，经一系列信号传导分子最终导致 NF-κB 等核因子的激活，调节与免疫有关的基因表达，产生多种细胞因子及刺激 DC 的成熟，发挥抗肿瘤作用。另一方面，TLRs/ NF-κB 通路也可能参与肿瘤的发生、发展。根据本研究结果初步推测，TLR9的表达在胃癌的发生发展中起作用，与相应配体(CpG ODN)结合后可产生抗肿瘤效应，有望用于临床诊断、胃癌患者的单一治疗或者临床辅助治疗，这不仅使患者获益更大，也有利于肿瘤免疫治疗研究的开展，具体机制将在后续研究中继续。

　　【参考文献】

　　[1]　于吉人.胃癌新辅助化疗的研究进展[J]. 实用肿瘤杂志， 2010， 25(5)： 594.

　　[2]　李煜淇， 张艳丽， 刘瑛. TLR9在胃癌细胞上的表达及其作用的实验研究[J]. 宁夏医科大学学报， 2010， 32(7)： 770-772.

　　[3]　Schmausser B， Andrulis M， Endrich S， Muller-Hermelink HK， Eck M： Toll-like receptors TLR4， TLR5 and TLR9 on gastric carcinoma cells： an implication for interaction with helicobacter pylori[J]. Int J Med Microbiol， 2005， 295： 179-185.

　　[4]　Holtick U， Scheulen ME， von Bergwelt-Baildon MS， et al. Toll-like receptor 9 agonists as cancer therapeutics[J]. Expert Opin Investig Drugs， 2011， 20(3)： 361-372.