肝癌外周血淋巴细胞和肿瘤细胞多药耐药基因表达的研究

　　作者：付晓华,李作生　　作者单位：066000 河北省秦皇岛市中医院(付晓华);华北煤炭医学院附属医院(李作生)

　　【摘要】目的探讨肝癌患者外周血淋巴细胞和肿瘤细胞多药耐药糖蛋白(P-gp)表达的相关性。方法 选取肝癌患者38例，应用流式细胞免疫荧光技术检测肿瘤细胞和外周血淋巴细胞多药耐药糖蛋白的表达。结果 38例肝癌肿瘤细胞P-gp阳性细胞率为(2.9%±0.9)%，外周血淋巴细胞P-gp阳性细胞率为(2.4%±0.8)%，肝癌肿瘤细胞与外周血淋巴细胞P-gp表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 肝癌患者可以应用外周血淋巴细胞代替肿瘤细胞进行多药耐药基因表达的检测，以提高药敏预测的准确性。

　　【关键词】 多药耐药基因;P-糖蛋白;流式细胞免疫荧光术

　　Study on multidrug resistance gene expression between peripheral blood lymphocytes and tumor cells in hepatocellular carcinoma 　FU Xiaohua*,LI Zuosheng.　*Qin huangdao Chinese Medical Hospital,Hebei,Qinhuangdao 066000

　　【Abstuact】 Objective To explore the correlation of multidrug resistance gene phenotypic expression of P-gp between peripheral blood lymphocytes and tumor cells in hepatocellular carcinoma patients. Methods The expression of multidrug resistance gene in hepatocellular carcinoma patients peripheral blood lymphocytes and tumor cells of 38 cases were detected by flow cytometric-immunology method. Results The positive rate of P-gp was 2.78%±0.92% and 2.36%±0.75% in tumor cells and peripheral blood lymphocytes respectively, there was no significant difference in P-gp expression between peripheral blood lymphocytes and tumor cells in hepatocellular carcinoma patients. Conclusion Peripheral blood lymphocytes could be replace tumor cells to detect the expression of P-gp to improve the accuracy of chemosensitivity test.

　　【Key words】 multidrug resistance gene;P-gp;flow cytometric-immunology

　　肝癌是世界上常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均高。目前，化疗仍然是肝癌治疗的最重要手段。然而，由于多药耐药性的存在，使得肝癌化疗效果差，并且随着化疗次数的增加，耐药性逐渐增加。检测多药耐药基因糖蛋白(P-gp)的表达以增加药敏试验的准确性，在P-gp表达阳性的肝癌患者中避免应用相关化疗药物，能够提高肝癌化疗效果，减少盲目用药，以指导个体化化疗。本研究采用流式细胞免疫荧光技术，检测肝癌肿瘤细胞和外周血淋巴细胞P-gp表达的相关性，对于不能获得肿瘤组织的肝癌患者应用外周血淋巴细胞代替肿瘤细胞进行P-gp表达的检测，从而指导临床选择敏感药物具有重要意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　1.1.1 标本：选择经手术治疗并经病理确诊的原发性肝癌患者38例，其中男30例，女8例;年龄40～58岁，平均年龄47岁。术前未经化疗。于术前采取外周静脉血，术中切取手术切除的新鲜肝癌组织。

　　1.1.2 试剂 鼠抗人单克隆抗体P170及免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG(一抗)，羊抗鼠IgG异硫氰酸荧光素标记(FITC)，淋巴细胞分离液。

　　1.2 方法

　　1.2.1 单细胞悬液制备：肝癌组织标本均取自手术切除的新鲜癌组织，选取无坏死部分，尽量剔除纤维组织，采用机械法获取肿瘤单细胞悬液[1，2]：用淋巴细胞分离液从外周静脉血中分离淋巴细胞，制备成单细胞悬液[1，2]。将肿瘤组织及淋巴细胞单细胞悬液分别收入10 ml试管内，以1 500 r/min离心10 min，弃去上清，再以PBS液2 ml漂洗，同速离心2次，均弃上清，以70%乙醇1 ml固定备用[3]。

　　1.2.2 免疫反应[3]：先以PBS将肿瘤细胞及淋巴细胞单细胞悬液漂洗1次，以1 500 r/min离心5 min，以除去固定剂，调整单细胞悬液细胞数在109/L左右。再将每份悬液分别装入两试管，其一加入20 μl 鼠抗人单克隆抗体P170(一抗)，其二加入20 μl 免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG(一抗，用以指示免疫反应中非特异结合细胞的数量，以便排除免疫反应误差)。室温下放置20 min，以2 000 r/min离心5 min，去除上清液后加1 ml PBS液漂洗，同上速度离心2次。再向两试管中各加入20 μl羊抗鼠IgG异硫氰酸荧光素标记(FITC)(二抗)，室温避光放置30 min，同上速度离心后去除上清液，以除去未结合的荧光抗体，以PBS漂洗离心2次，均弃上清液，最后加入500μl PBS待检。

　　1.2.3 流式细胞仪检测：应用FACScan型流式细胞仪收集检测2万个细胞。多药耐药基因表达产物P-gp含量以P170阳性细胞百分率表示。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS 12.0版本进行数据处理，计量资料以率表示，采用t检验，分析肝癌肿瘤细胞和外周围血淋巴细胞P-gP表示的差异，用双变星相关分析(Bivaraite Correlation)方法分析肝癌肿瘤细胞和外周细胞P-gP表达相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　外周血淋巴细胞P170阳性细胞百分率为(2.4±0.8)%，肝癌肿瘤细胞P170阳性细胞百分率为(2.8±0.9)%，二者相比差异无统计学意义(P>0.05)。外周血淋巴细胞P170阳性细胞百分率与肿瘤细胞P170阳性细胞百分率呈明显正相关(相关系数r=0.323，P<0.05)。

　　3 讨论

　　多药抗性的肿瘤细胞的一个明显特征，是MDR1过度表达P-gp。P-gp位于细胞膜上，其作用是加快化疗药物从癌细胞的排泄，是肿瘤细胞自身保护的重要机理之一[4]。侍作亮等[5]研究认为，在未接触化疗药物的原发性肝癌组织中，54.55%～60.00%有MDR1基因扩增和P-gp表达，预示着这些肿瘤细胞对化疗药物存在不同程度的耐药性，即天然耐药。其研究结果认为外周血有核细胞和肝癌肿瘤细胞P-gp的表达水平显著相关，外周血中MDR1基因的表达水平反映了肿瘤组织中该基因的表达水平。尹格平等[6]研究认为卵巢癌患者的外周血淋巴细胞和卵巢癌组织P-gp表达差异无统计学意义，通过检测外周血淋巴细胞P-gp的含量能间接反映卵巢癌对化疗药物的耐药程度。褚忠华等[7]研究了体外化疗药敏试验及流式细胞P-gp的检测，认为在应用体外化疗药敏试验选取化疗药物的同时检测P-gp的表达，能够更好的指导临床选用敏感化疗药物。本研究结果与以上研究结果一致，说明肝癌患者的外周血淋巴细胞和肿瘤细胞P-gp表达具有明显相关性，根据外周血淋巴细胞P-gp表达情况可以判断肿瘤细胞P-gp表达情况，因此在无法获得肿瘤组织的患者中，可以应用外周血淋巴细胞代替肿瘤细胞进行P-gp的检测，以提高药敏试验的准确性。

　　【参考文献】

　　1 袁淑兰，王艳萍，姜曙，等.外周血淋巴细胞和肿瘤细胞体外化疗药敏相关性研究.华西医大学报，2000，31：338-340.

　　2 覃理灵，廖维甲，梅铭惠.利用MTT法检测肝癌化疗药物的敏感性.华夏医学，2007，20：39-40.

　　3 尹格平，孙晓明，陈诵芬.恶性实体瘤细胞多药耐药基因(MDR1)表达产物流式细胞术检测方法的建立及临床意义.中国肿瘤临床，1998，25：489-491.

　　4 Nooter K，Herweijer H.Multidrug resistance (mdr) genes in human cancer.Br J Cancer，1991，63：661-665.

　　5 侍作亮，陈孝平，李东华，等.外周血肝癌多药耐药荧光定量检测及意义.中华实验外科杂志，2003，20：619-620.

　　6 尹格平，陈诵芬，孙晓明，等.卵巢癌组织及外周血淋巴细胞多药耐药基因表达蛋白的定量研究.中华妇产科杂志，1998，33：287-289.

　　7 褚忠华，陈涛，王捷，等.体外化疗药敏试验系统联合流式细胞仪在胃肠肿瘤化疗中的应用.中华胃肠外科杂志，2003，6：120-123.