同活化表型的巨噬细胞对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响

　　作者：章必成,王俊,赵勇,高建飞　　作者单位：1第三军医大学新桥医院全军肿瘤诊治中心,重庆市肿瘤生物技术研究所,重庆400037;2广州军区武汉总医院肿瘤科,武汉430070

　　提　要:目的　探讨不同活化表型的小鼠巨噬细胞对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞增殖和侵袭的影响。方法　分别以

　　mr IFN-γ+LPS、mr IL-4处理小鼠RAW264. 7巨噬细胞, 24 h后以RT-PCR鉴定它们表达经典活化的巨噬细胞(caMphi)或替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)的标识iNOS或Fizz1的情况。采用Transwell系统共培养活化的巨噬细胞(分为4组:空白对照组、caMphi组、aaMphi组、RAW264. 7组)和LLC细胞,绘制LLC细胞生长曲线,并以免疫细胞化学法检测LLC细胞表达血管内皮生长因子-C(VEGF-C)情况,以硝酸还原酶法检测培养液上清中NO含量。分别采用3H-TdR掺入法和Tran-swell侵袭模型观察活化的巨噬细胞对LLC细胞增殖和侵袭的影响。结果　成功地建立了小鼠caMphi和aaMphi模型。在4个共培养组中, aaMphi组的LLC细胞生长最快,表达VEGF-C最强,RAW264. 7组次之; caMphi组大量分泌NO,其余3组未见NO分泌。通过3H-TdR掺入法和Transwell侵袭模型观察到, aaMphi组的LLC细胞增殖速度最快,侵袭能力最强;RAW264. 7组次之; caMphi组的LLC细胞的增殖和侵袭则受到抑制。结论　aaMphi能够促进LLC细胞的增殖和侵袭,与其上调后者表达VEGF-C有关; caMphi能够抑制LLC细胞的增殖和侵袭,与其大量分泌NO有关。在与LLC细胞共培养后,RAW264. 7细胞的功能朝着aaMphi的方向极化。

　　关键词:巨噬细胞;活化表型;Lewis肺癌;增殖;侵袭

　　中图法分类号:R392. 12;R730. 2;R734. 2　　　文献标识码:A

　　Effect ofmacrophageswith different activated phenotype on proliferation and inva-

　　sion ofLewis lung carcinoma cellsZHANG Bi-cheng1,WANG Jun1,ZHAO Yong2,GAO Jian-fei2,GUO Yan1,CHEN Zheng-tang1(1CancerResearch Center,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400037;2DepartmentofOncology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitary Command,Wuhan 430070,China)

　　Abstract:Objective　To explore the effect ofmouse macrophageswith different activated phenotype onthe proliferation and invasion ofmouse Lewis lung carcinoma(LLC)cells.Methods　RAW264. 7 macropha-

　　geswere treated bymr IFN-γ+LPS ormr IL-4 for24 h respectively,then identified byRT-PCR to detect iN-

　　OS--themarker of classically activatedmacrophages(caMphi)and Fizz1--themarker of alternatively activatedmacrophages(aaMphi). Based on the co-cultureTranswell systems ofactivatedmacrophages(4 groups:blankcontrol group,caMphi group,aaMphi group andRAW264. 7 group)and LLC cells,cellgrowth curves ofLLCcellswere drawn,vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C)expressions ofLLC cellswere detected byimmunocytochemistry,andNO concentrations of co-culture fluid supernatantwere determined by nitrate reductase method.3H-TdR incorporation and Transwell invasion modelwere used to observe the effect of activatedmacrophages on the proliferation and invasion ofLLC cells,respectively.Results　Mouse caMphi and aaMphimodelswere established successfully. Among the 4 co-culture groups,the growth ofLLC cells andVEGF-C expression were the fastestand strongest in aaMphigroup,secondary inRAW264. 7 group;NO concentrationwashigh in caMphi group,butnoNO was determined in the other3 groups. The proliferation and invasion ofLLCcellswere promoted most in aaMphi group,then in RAW264. 7 group,but inhibited in caMphi group.Conclusion　aaMphi can promote the proliferation and invasion ofLLC cells by the promotion ofVEGF-C expression. caMphi can inhibitthem byhigh levelproduction ofNO. Afterco-culturewithLLC cells, the functionofRAW264. 7 cellsmay be polarized toward thatof aaMph.i

　　Key words:macrophage; activated phenotype; Lewis lung carcinoma; proliferation; invasion

　　近10年来,人们逐渐认识到在不同的环境中,巨噬细胞可以发生不同性质的活化,成为具有不同活化表型和功能特征的亚群[1]:①经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophages, caMphi);②替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophages,aaMphi);③Ⅱ型活化的巨噬细胞。其中,前两者与肿瘤的进展和转移密切相关。肿瘤间质中存在着大量的巨噬细胞,即肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmac-rophages, TAM),但其活化表型、功能特征和作用机制尚不明确。本研究拟通过观察不同活化表型的巨噬细胞对小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma, LLC)细胞增殖和侵袭的影响,以期为明确TAM在肺腺癌进展和转移过程中的作用提供理论依据。

　　1　材料与方法

　　1. 1　材料

　　1. 1. 1　主要试剂

　　DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司。小鼠重组IFN-γ、小鼠重组IL-4购自Cytolab公司。LPS购自Sigma公司。基质胶购自BD公司。兔抗鼠血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)抗体、免疫细胞化学试剂盒和DAB试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。3H-TdR购自北京原子能研究所。Tripure购于Roche公司,反转录试剂盒购于MBI公司, PCR试剂盒购于TaKaRa公司。

　　1. 1. 2　细胞株

　　小鼠RAW264. 7巨噬细胞(以下简称RAW264. 7细胞)和小鼠LLC细胞购自美国典型细胞中心。

　　1. 1. 3　引物设计

　　小鼠iNOS、Fizz1和β-actin 3对PCR引物由上海生工公司合成。具体序列如下:小鼠iNOS(191 bp):上游5′-CACGGACGAGACGGATAG-3′,下游5′-GGGAGGAGCT-GATGGAGT-3′;小鼠Fizz1(196 bp):上游5′-GCCAATCCAGCT-

　　AACTATCC-3′,下游5′-CAGTGGTCCAGTCAACGAG-3′;小鼠β-actin (455 bp):上游5′-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3′,下游5′-GTCTTTACGGATGTCAACG-3′。

　　1. 2　方法

　　1. 2. 1　小鼠巨噬细胞的活化及表型鉴定

　　参考Edwards等[2]的方法。取对数生长期的RAW264. 7细胞以2×105/孔接种于6孔培养板中。待细胞贴壁后,分别以小鼠重组IFN-γ(终浓度100 IU/ml)+LPS(终浓度10μg/L)、小鼠重组IL-4(终浓度10 IU/ml)处理之, 24 h后即可建立起caMphi和aaMphi模型。以未经处理的RAW264. 7细胞为对照组。分别收集3组细胞各1×107个,用Tripure提取总RNA。取RNA 2μg进行cDNA合成: 70℃5 min→37℃5 min→42℃60 min→70℃10 min→冰上; PCR扩增: 94℃预变性1. 5 min→94℃1 min→56℃1 min→72℃1 min→72℃延伸5 min, 34个循环; PCR产物以1. 5%琼脂糖凝胶电泳1 h后,扫描图像。每组3个样本。

　　1. 2. 2　活化的巨噬细胞与LLC细胞共培养系统的建立

　　选择孔径为0. 4μm的上室和24孔培养板(下室)建立起Tran-swell共培养系统。首先在下室内接种1 ml(含细胞1×104个)处于对数生长期的LLC细胞, 4 h后在上室内接种各种活化表型的巨噬细胞1 ml(含细胞1×104个),然后共培养。根据上室内的细胞类型分为:①空白对照组:未接种任何细胞;②caMphi组:接种caMph;i③aaMphi组:接种aaMph;i④RAW264. 7组:接种未经处理的RAW264. 7细胞。

　　1. 2. 2. 1　绘制LLC细胞生长曲线

　　上述各共培养组分别设6个时间平行孔,每个时间点又设3个复孔。每隔24 h、连续6 d分别对下室的LLC细胞进行台盼蓝染色。计算每个时间点的平均活细胞数。以培养时间为横坐标、平均细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

　　1. 2. 2. 2　免疫细胞化学检测LLC细胞VEGF-C表达

　　在共培养的过程中,将一干净无菌的盖玻片置于培养孔中以制备细胞爬片。24 h后取出该爬片。以兔抗鼠VEGF-C抗体(1∶100)为一抗,以生物素化的羊抗兔IgG为二抗进行免疫细胞化学染色。采用CMIAS-Ⅱ多功能真彩色病理图像分析仪进行光密度测定,其值(IOD)代表VEGF-C阳性表达的相对强度。每个样本选取5个视野(×200),取平均值进行比较。

　　1. 2. 2. 3　硝酸还原酶法测定共培养液上清NO含量

　　取共培养24 h后的各组培养液上清严格按试剂盒说明书操作。每组3个样本,取平均值计算。

　　1. 2. 3　3H-TdR掺入法观察LLC细胞增殖状况

　　于实验前晚将LLC细胞半量换液,实验时取1×106个细胞,以不含FBS的培养液洗涤3次,最后将细胞悬浮于0. 5 ml完全培养液中;加3H-TdR 3. 7×105Bq,放入孵箱孵育3 h,每30分钟轻摇1次;标记结束时加FBS数滴,洗去游离同位素,加完全培养液洗浴30 min,调整细胞浓度2×105/ml备用。将不同活化表型的巨噬细胞(同样设为4组,浓度1×106/ml)及LLC细胞各1 ml(5∶1)加入Transwell共培养系统(孔径为0. 4μm)的上室和下室中,在孵箱中作用20 h后,多功能低温离心机低速离心5 min收集下室的LLC细胞;加混合酶(0. 8%胰酶与0. 05% DNA酶对倍稀释而成)1 m,l作用30 min后,用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上,烘干后放入闪烁杯送检脉冲数(cpm)。cpm代表3H-TdR的掺入量,反映LLC细胞的增殖状况。每组设3个复孔,取其平均值计算。增殖指数(proliferation index,PI)的计算: PI=共培养组的cpm /空白对照组的cpm。

　　1. 2. 4　Transwell侵袭模型检测LLC细胞侵袭能力

　　选择孔径为8μm的上室和24孔培养板(下室)建立起Transwell侵袭模型,其中上室内铺基质胶30μg,下室加入1. 2. 2中各共培养组的培养液上清1 ml。分别将1 ml(含细胞1×104个) 1. 2. 2中各共培养组的LLC细胞接种于上室中, 24 h后取出上室,用棉签擦去内表面的基质胶和细胞。将其置入95%乙醇中固定10 min,行HE染色。倒置相差显微镜下照相,计数迁移到上室外表面的细胞数目。以穿膜细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。每个样本计数5个视野(×200)的细胞数,取平均值进行比较。

　　1. 3　统计学处理

　　计量资料用-x±s表示,采用SPSS 13. 0统计软件进行单因素方差分析。

　　2　结果

　　2. 1　小鼠巨噬细胞的活化及表型鉴定

　　RT-PCR显示, 3组均可见明亮的β-actin内参照条带且无明显差别;未经处理的RAW264. 7细胞未见iNOS和Fizz1条带; IFN-γ+LPS处理的RAW264. 7细胞可见明亮的iNOS条带,未见Fizz1条带; IL-4处理的RAW264. 7细胞可见明亮的Fizz1条带,未见iNOS条带(图1)。由于iNOS和Fizz1分别是caMphi和aaMphi的特异性标识,故本研究再次证实了IFN-γ+LPS、IL-4可以分别作为caMphi和aaMphi的诱导剂。M:DNA标准;1:对照组;2:caMphi组;3:aaMphi组

　　图1　不同活化表型的巨噬细胞总RNA RT-PCR产物凝胶电泳图

　　2. 2　绘制LLC细胞生长曲线

　　根据各组台盼蓝染色活细胞计数绘制生长曲线如图2。aaMphi组和RAW264. 7组的LLC细胞生长速度较快,明显高

　　于空白对照组(P<0. 05),其中又以aaMphi组最快;而caMphi组的LLC细胞生长则受到抑制。此结果表明, aaMphi和

　　RAW264. 7细胞能够促进LLC细胞生长,而caMphi则抑制其生长。

　　a:P<0•05,与空白对照组比较

　　图2　不同活化表型的巨噬细胞与LLC细胞共培养时的细胞生长曲线

　　2. 3　免疫细胞化学检测LLC细胞VEGF-C表达

　　相对于空白对照组和caMphi组, aaMphi组和RAW264. 7组细胞数目较多,且细胞形态稍有改变。4组LLC细胞VEGF-

　　C阳性表达情况见图3,其IOD分别为(44. 53±8. 76)、(42. 19±3. 52)、(264. 19±13. 36)和(118. 51±10. 82)。相对于空白对照组, aaMphi组和RAW264. 7组VEGF-C表达阳性明显增加(P<0•01),又以aaMphi组为最强; caMphi组和空白对照组无统计学差异(P>0•05)。说明aaMphi和RAW264. 7细胞能够上调LLC细胞VEGF-C表达。

　　2. 4　硝酸还原酶法测定共培养液上清NO含量

　　caMphi组的NO含量为(234. 12±14•83)μmol/L,空白对照组、aaMphi组和RAW264. 7组均未能检测到NO的产生,说明caMphi组能够大量分泌NO。

　　A:空白对照组;B:caMphi组;C:aaMphi组;D:RAW264. 7组

　　图3　不同活化表型的巨噬细胞诱导LLC细胞表达VEGF-C的比较　(SABC×200)

　　2. 5　3H-TdR掺入法观察LLC细胞增殖状况

　　caMphi组、aaMphi组和RAW264. 7组LLC细胞的PI分别为(0. 51±0. 08)、(2. 87±0. 43)和(1. 17±0. 28)。aaMphi组与caMphi组、RAW264. 7组之间均存在统计学差异(P<0•01,P<0•05), RAW264. 7组与caMphi组之间也存在着统计学差异(P<0•01),说明aaMphi和RAW264.7细胞能够促进LLC细胞增殖,其中又以aaMphi最为明显,而caMphi则抑制其增殖。

　　2. 6　Transwell侵袭模型检测LLC细胞侵袭能力

　　与空白对照组相比, aaMphi组的透膜细胞明显增多(P<0•01),RAW264. 7组次之(P<0•01),而caMphi组几乎没有发现透膜细胞(图4),说明aaMphi和RAW264. 7细胞能够促进LLC细胞侵袭,而caMphi则抑制其侵袭。

　　1015A:空白对照组;B:caMphi组;C:aaMphi组;D:RAW264. 7组

　　图4　不同活化表型的巨噬细胞对LLC细胞侵袭能力的影响　(HE×200)

　　3　讨论

　　caMphi又称为M1巨噬细胞。产生caMphi需要两个信号: IFN-γ和外源性TNF或内源性的TNF诱导剂。caMphi是通常意义上起正向作用的效应细胞,可以杀伤病原体和肿瘤细胞。表达iNOS是caMphi最重要的特征和标识。aaMphi又称为M2巨噬细胞。产生aaMphi不需要双信号,但需要有合适的诱导剂如IL-4、IL-13和糖皮质激素等。aaMphi的功能主要是[1]:①能诱导产生精氨酸酶1(arginase 1, Arg-1),使得巨噬细胞甘露糖受体(macrophagemannose receptor, MMR)和清道夫受体表达上调,而产生NO的能力下降,因此杀伤病原体的能力下降,但是清除机体残留物质的能力较强。②能分泌纤维连接蛋白和基质相关蛋白βIG-H3,加之Arg-1能诱导聚胺和脯氨酸生成,因而能促进血管生成、胶原

　　及纤维形成和细胞外基质沉积。③虽然能上调MHCⅡ分子的表达,但并不能有效地递呈抗原,因而主要是抑制T细胞增殖。在不同的组织中,Arg-1、MMR、AMAC-1、MGL、Fizz1和Ym等均可以作为aaMphi的标识。

　　TAM是肿瘤间质中数量最多的炎症细胞群。研究表明,它们参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程,尤其是与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关[3]。在肺癌中,虽然有研究者认为间质TAM不能作为独立的预后因子[4],但是更多的研究则持相反的观点。Chen等[5]通过检测人肺癌标本观察到, TAM数量和微血管密度呈正相关,与无复发生存期呈负相关;将人巨噬细胞和肺癌细胞株共培养发现,后者的侵袭能力和降解基质的活性明显增加, IL-8、MMP-9、VEGF、VEGF-C和MMP-1等基因表达明显上调。但是迄今为止,尚少见有关aaMphi与肺癌关系的报道,TAM的活化表型也未得以明确。虽然Sica等[6]曾指出,TAM可能发生替代性活化,呈现出aaMphi的表型,但此观点只是停留在“假说”的层面,尚未得到相应实验的充分证明。

　　我们首先建立了不同活化表型的巨噬细胞模型,进而发现aaMphi能够促进LLC细胞的增殖和侵袭,而caMphi则抑制其增殖和侵袭,前者与aaMphi上调LLC细胞表达VEGF-C有关,后者与caMphi大量分泌NO相关。此结果不仅首次在亚群水平明确了活化的巨噬细胞与LLC细胞的关系,而且提示肺腺癌间质TAM的活化表型可能主要是替代性活化,或者说,在这些TAM中, aaMphi在数量和功能上占据优势,因而呈现出促进肿瘤增殖和侵袭的功能。此外,我们还发现未经任何外源性处理的RAW264. 7细胞在与LLC细胞共培养后,也表现出了与aaMphi相似的功能特点。这不仅再次证实了Chen等[5]的研究结果,而且与Hage-mann等[7]的研究结果有相似之处。并再次提示肺腺癌间质TAM可能就是一种aaMphi。

　　鉴于aaMphi在肺腺癌中可能具有的重要作用,它有望成为一个崭新的肿瘤治疗靶点[8]:通过消除肿瘤微环境中存在的诱导产生aaMphi的因素或者通过外源性因素逆转aaMphi的活化表型,可能恢复巨噬细胞的免疫活性和细胞毒作用,从而达到抑制肿瘤进展和转移的目的。然而,TAM是否就是aaMph,i TAM的表型变化是如何调控的以及TAM如何发挥促进肿瘤进展和转移的作用等问题目前仍未解决。有关TAM的活化表型问题及其在肺腺癌中的作用,我们正在进行进一步的研究。

　　参考文献:

　　[1] MosserD M. Themany faces ofmacrophage activation[J]. J LeukocBio,l 2003, 73(2): 209-212.

　　[2] Edwards J P, ZhangX, FrauwirthK A,et al. Biochemical and functional characterization of three activatedmacrophage populations[J]. JLeukoc Bio,l 2006, 80(6): 1298-1307.

　　[3] LewisC E, Pollard JW. Distinctrole ofmacrophages in different tumormicroenvironments[J]. CancerRes, 2006, 66(2): 605-612.

　　[4] Ogawa E, Takenaka K, Yanagihara K,et al. Clinical significance ofVEGF-C status in tumour cells and stromalmacrophages in non-smallcell lung cancerpatients[J]. Br JCancer, 2004, 91(3): 498-503.

　　[5] Chen J J, Lin Y C, Yao P L,et al. Tumor-associated macrophages:the double-edged sword in cancerprogression[J]. JClinOnco,l 2005,23(5): 953-964.

　　[6] Sica A, Schioppa T, MantovaniA,et al. Tumour-associated macrophages are a distinctM2 polarised population promoting tumourprogression: potential targets ofanti-cancer therapy[J]. Eur JCancer, 2006,42(6): 717-727.

　　[7] Hagemann T, W ilson J, Burke F,etal. Ovarian cancer cells polarizemacrophages toward a tumor-associated phenotype[ J]. J Immuno,l2006, 176(8): 5023-5032.

　　[8] ColomboM P, MantovaniA. Targetingmyelomonocytic cells to revertinflammation-dependent cancer promotion[J]. CancerRes, 2005, 65(20): 9113-9116.