乳腺癌前哨淋巴结活检和外周血细胞角蛋白19(CK-19)对转移的联合检测

　　作者：崔嵘嵘,林晓燕,胡赟宏,王铮元,许诚　　作者单位：上海，同济大学附属杨浦医院乳腺外科

　　【摘要】 目的 分析采用不同方法同时检测乳腺癌患者前哨淋巴结(SLN)和外周血细胞角蛋白19(CK-19),以探讨联合检测对预测乳腺癌转移的意义。方法 对40例可手术的原发性乳腺癌患者行前哨淋巴结活检(SLNB),同时采用RT-PCR技术测定外周血CK-19mRNA表达状态,分析这两种方法对乳腺癌患者转移的检出率。结果 40例乳腺癌患者SLNB检出10例阳性,(阳性率25%)，其中2例为微转移;1例为假阴性;同时以外周血CK-19mRNA监测微转移，其中22例患者呈阳性表现(阳性率55%)。同时有SLN与CK-19mRNA阳性患者4例，而SLNB阴性患者有18例其CK-19mRNA阳性，二者之间呈正相关(P<0.01)。结论 CK-19mRNA可作为标志物来检测乳腺癌外周血中的微转移情况，而乳腺癌前哨淋巴结活检可发现有无腋下淋巴结转移，避免盲目清扫腋下淋巴结。但即使术前常规检查未发现腋窝淋巴结及远处转移,其外周血也可检出微小转移灶。因此，临床上需要检测多种组织、多个指标,才能更精确地对微小转移进行评价。

　　【关键词】 乳腺癌;前哨淋巴结活检;微转移;CK-19;RT-PCR

　　【Abstract】 Objective To observe the significance of joint detection between SLNB and CK-19 mRNA in peripheral blood of breast cancer.Methods SLNB and CK-19 mRNA detect in peripheral blood by RT-PCT in 40 breast cancer patients ,all of which are operationable.Results There are 10 patients which SLNB was positive(positive rate was 25%);and there are 22 patients which CK-19 mRNA was positive(positive rate was 55%);meanwhile,there are 4 patients were positive all in two ways,and 18 patients CK-19 mRNA was positive but SLNB was negative(P<0.01).Conclusion CK-19 mRNA can be used to detect the micro-metastases in peripheral blood,and the SLNB can also find the metastasis in axillary lymph node to avoid blind clean the axillary.In this study wen can find that even if the SLNB negative,the micrometastasis can also be found in peripheral blood.So we suggest that we should detect various of organization and index to evaluation the metastasis more precisely.

　　【Key words】 breast cancer; sentinel lymph node biopsy(SLNB);micro metastasis; CK-19;RT-PCR

　　正确、及时判断肿瘤转移特别是临床上常规检查难以发现的早期转移仍然是研究的重点和难点。乳腺癌早期以淋巴转移为主。前哨淋巴结活检(SLNB)旨在发现早期淋巴结转移灶,避免不必要的腋窝清扫,同时指导下一步治疗。但在淋巴结转移前是否已存在癌细胞的外周血转移尚不为知。细胞角蛋白19(cytokeratinl9，CK-19)是针对上皮细胞的单抗，仅在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中表达，是检测上皮性肿瘤转移的良好标志[1]。RT-PCR是目前公认的检测微转移最敏感而且高特异性的方法，能检测存在于血液系统、淋巴结和骨髓中的微转移灶[2]。本研究通过同时测定乳腺癌患者外周血CK-19mRNA及前哨淋巴结活检,探讨乳腺癌淋巴结转移与外周血微转移之间有无交叉,来指导术后综合治疗,从而进一步提高转移灶检出率。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　采集本院自2011年1-10月经病理确诊乳腺癌患者40例，这40例患者均为I/II期，年龄36～67岁,中位年龄49.5岁(具体情况见表1),均未行新辅助化疗,术前均未有腋窝淋巴结肿大迹象,同时腋窝无手术史。手术中均行肿块周围或乳晕周围注射亚甲蓝进行SLN定位成功,同时常规行腋窝淋巴结清扫,术后对SLN和非SLN均行常规病理学检测。同时采用RT-PCR法于术前采集患者外周血行CK-19mRNA表达状况测定。

　　1.2 SLN定位活检方法及取材

　　术前皮肤消毒后用1%亚甲蓝2ml沿肿块周围乳腺内或乳晕边缘向乳晕部皮内注射,按压注射部位15min后，常规游离皮瓣，在腋窝处寻找蓝染前哨淋巴结,将淋巴结一一分离，并送石蜡病理。40例术中确定全部找到SLN。其中2例患者SLN未检出转移灶,但腋窝处非兰染淋巴结检出转移。表1 40例乳腺癌患者具体情况一览表

　　1.3 RT-PCR测定

　　40例患者术前均抽取外周血2ml行CK-19mRNA检测。

　　1.3.1 单个核细胞分离和RNA提取

　　取草酸钾抗凝全血标本2ml沿离心管缓缓加入2ml淋巴细胞分离液中，4℃、3000rpm水平离心10min后取中间层移入 EP 管，4℃、10000rpm离心5min，弃去上清，将沉淀溶于500μl Trizol。加入200μl氯仿，充分混匀，4℃、10000rpm离心10min，将上清吸入1.5ml离心管(大约300μl)，按1：3比例加入异丙醇900μl，放入-80℃冰箱冷冻室60min以上(或冰浴20min以上);以下冰上操作：4℃、12000rpm以上离心15min，弃去上清，加入75%酒精(DEPC处理水配制)600μl，吹匀沉淀，4℃、8000rpm离心5min，弃去上清(尽量吸干)，用金属浴干燥沉淀(65℃，5min之内，开盖)，加入DEPC处理水15μl，吹匀沉淀，取高压灭菌过的0.5mlEP管，分别加入Rt-mix 7μl和上述RNA 3μl，混匀，离心片刻，37℃金属浴，15min，85℃金属浴，5s，4℃、10000rpm离心15min，扩增试剂离心片刻，PCR-primer和探针分别加440μl DEPC处理水稀释备用。

　　1.3.2 RT-PCR引物和探针

　　(由上海达为科生物科技有限公司提供)CK-19 TaqMan 探针：5’-FAM-ACCAGCCGGACTGAAGAATTGAACCG-TAMRA-3’，5’端FAM修饰;3’端Tamra修饰;CK-19 上游引物序列： 5’-AGAACCGGAAGGATGCTGAA-3’; CK-19 下游引物序列： 5’-GTAACCTCGGACCTGCTCATCT-3’。

　　1.3.3 RT-PCR扩增

　　配制扩增体系如下(每反应管)：Taq酶2μl;上游引物5μl;下游引物5μl;探针5μl;DEPC水7μl;Marxers Mix 8μl;cDNA 2μl。扩增条件设置如下：第一阶段：50℃，2min，Reps 1;第二阶段：95℃，10min，Reps 1;第三阶段：循环 1：95℃，15sec;循环2：60℃，1min Reps 40。标准曲线的建立：采用BIECHE[3]的标准曲线制备方法，每次扩增均使用标准品制备标准曲线，范围为10-2～10-6拷贝/ml(见图1)。定量分析：根据标准曲线，仪器自动计算出标本中每毫升CK-19GAPDH的拷贝数，以CK-19和GAPDH的比值作为其的表达水平。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS10.0软件包进行数据统计分析,采用行×列表的卡方检验，所有结果P<0.05为差异有统计学意义，P>0.05为差异无统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SLN的检出情况及腋窝淋巴结常规HE染色病理检测情况

　　40例患者术中取出腋窝淋巴结共720枚，每例平均18枚。共取出SLN 126枚，每例平均3.15枚。常规HE染色结果腋窝淋巴结有转移者10例，其中SLN阳性9例，1例SLN阴性而非SLN阳性，假阴性率为10%。30例腋窝淋巴结未发现转移灶，SLN病理检测的阳性率为25%。

　　2.2 CK-19mRNA在外周血的表达情况

　　40例患者CK-19扩增曲线(见图2)。根据标准曲线,仪器自动计算出标本中每毫升CK-19mRNA的拷贝数,范围为13.2±3.6(×102拷贝/ml)，CK-19/GAPDH 范围为4.5±0.9(×103)。取其平均值4.5,若大于平均值则为阳性表达,若小于平均值则为阴性表达。

　　2.3 40例患者前哨淋巴结的HE染色检测与RT-PCR检测细胞角蛋白CK-19mRNA结果的比较

　　见表2。表2 40例前哨淋巴结的HE染色检测与RT-PCR检测细胞角蛋白CK-19mRNA结果的比较

　　2.4 行×列表的卡方检验

　　卡方值为15.28,P<0.01,二者之间差异有统计学意义。

　　3 讨论

　　细胞角蛋白(cytokeratin，CK)是上皮细胞骨架的组成成分,其作为上皮特异性的标志物,在上皮源性肿瘤细胞中存在,其中CK-19在乳腺癌中特异性最高[4]。CK-19是具有高度组织特异性和在乳腺癌细胞中广泛表达的细胞角蛋白，是检测乳腺癌微转移最有价值的标志物[5]。临床上常将CK-19作为标志物用于乳腺癌淋巴结、骨髓和外周血微小转移的检测。SLN是原发肿瘤细胞在引流区域淋巴结转移过程中首先累及的一个(组)特殊淋巴结，其存在说明癌细胞转移是按一定顺序经淋巴管首先转移至SLN，再进一步转移至远处淋巴结，跳跃式淋巴结转移的概率非常低。这为早期乳腺癌手术不行腋淋巴结清扫提供了理论依据[6，7]。通常情况下,乳腺癌的转移遵循先淋巴道再血道转移。但是是否存在一种现象,即淋巴结存在转移之前,就已有外周血转移?本研究发现,在一部分患者前哨淋巴结尚未出现转移之前就已检测出外周血CK-19升高,这就意味着部分患者在早期就存在血运转移。其机理,笔者认为,从细胞突变形成癌细胞后不断增殖,最后形成实体瘤期间,可能已有一部分癌细胞进入外周血。至于形成微转移的肿瘤细胞是否会形成肉眼转移灶，与肿瘤细胞活性、微环境以及机体免疫能力等因素有关。因为研究发现播散的肿瘤细胞可能发生凋亡，或者被免疫系统识别杀伤，或者处于休眠状态，当机体遭受某种严重打击或免疫能力下降，静止的肿瘤细胞就将摆脱受抑制状态而持续增殖，并发展为临床可见肿瘤。基于以上基础,并通过本研究证实,笔者认为,应对早期可手术乳腺癌患者,加强前哨淋巴结和外周血微转移的联合检测,以尽早发现可疑转移灶,并进行积极的相关治疗,以提高转移检出率,减少转移和复发率。

　　(本文图片见封三)

　　【参考文献】

　　1 Zhang J,Shen KW,Liu G,et al.antigenic profiles of disseminated breast tumourcells and microenvironment in bone marrow.Eur J Surg.Oncol,2003,29(2):121-126.

　　2 郭文忠，李申德.RT-PCR技术检测外周血中的肿瘤细胞.国外医学·临床生物化学与检验学分册，1997，18(1)：17-19.

　　3 Desjardin LE,Chen Y,Perkins MD,et al.Comparison of the ABI 7700 system(TaqMan) and competitive PCR for quantificationof IS6110 DNA in sputum during treatment of turberculosis. J Clin Microbiol,1998,36(7):1964-1968;91(3):569-575.

　　4 Schoeneld A,Kruger KH,Gomn J,et al.The detection of micrometastases in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemistry and reverse transcrtptase polymerase chain reaction for keratin 19.Eur J Cancer,1997,33(6):854-861.

　　5 Zhang J,Shen KW,Liu G,et al.antigenic profiles of disseminated breast tumourcells and microenvironment in bone marrow (J).Eur J Surg.Oncol,2003,29(2):121-126.

　　6 Fonti R，Limite G，Sodano A，et al.Sentinel lymph nodeiden-tification in breast cancer patients.Radio Med，2002，103(4)：370.

　　7 Moonka R，Hunter JA，Cray WK，et al.Acomparison of rates of lymph node metastases between patients undergoing sentineland axiflary lymphadenecmmy.Am J Sorg，2002，183(5)：558.