树突状细胞及其抗肿瘤疫苗

　　【关键词】 树突状细胞,抗肿瘤疫苗

　　肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后于20世纪90年代逐渐发展、成熟起来的一种新的肿瘤治疗方法。其基本理论依据是：通过调节或增强机体固有的内在性防御机制(主要为机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫排斥) 来抑制或杀伤肿瘤细胞，或通过抑制肿瘤细胞转化，促进恶性细胞分化来降低肿瘤的恶性程度。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强大的专职抗原呈递细胞，由于其具有激活初始T细胞的能力，因而被认为是机体免疫的始动者，在抗肿瘤免疫方面起着重要的作用。现就树突状细胞以及利用树突状细胞制备抗肿瘤疫苗的研究现状作一综述。

　　1　　树突状细胞的生物学特性和功能树突状细胞是1973 年Steinman 和Cohn首先从小鼠脾脏组织中分离发现的，因其具有典型的树突状突起而命名[1]。现在人们认识到,DC并非为一种或一类均一的细胞，它实际上代表了一个由数种表型和功能各异的细胞所组成的生物系统。不成熟DC广泛分布于除脑及角膜中央部以外的全身各组织中，具有很强的吞噬、加工处理抗原的能力，但其抗原提呈功能相对较弱。当受抗原刺激后，不成熟DC可以摄取抗原并对其进行加工处理，以主要组织相容性复合体(MHC)I/抗原肽或MHCII/抗原肽段复合物形式将其表达于细胞表面，同时在相关细胞因子：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF) 、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1( IL1)、巨噬细胞炎症蛋白2α(MIP2α) 和MIP2β等的趋化作用下迁移至二级淋巴组织，在迁徙过程中发育为成熟DC。现已证实DC成熟过程中迁移能力的变化与趋化因子受体表达改变有关[2]，DC 摄取抗原后，通过自分泌机制上调表达MIP1α、MIP1β和RANTES等炎性趋化因子引起同族CCR1和CCR5受体下调，并上调表达CCR7，获得与其配体SLC和ELC的反应性，SLC和ELC主要由次级淋巴器官内皮细胞和T、B 细胞区的间质细胞分泌产生,从而使DC 进入局部淋巴结的T 细胞区,诱发免疫应答。成熟DC含有很多无规则树枝状或管状的胞浆突起，同时细胞膜表面的MHCII类分子表达上调，粘附分子和共刺激分子的表达明显增加。粘附分子包括CDIIα(LFA1)、CDIIc、CD50 (ICAM2)、CD54(ICAM1)、CD58(LFA3)、CD102(ICAM3)等。刺激分子如CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40。并出现DC成熟标志CD83、CD80、CD86等[3]。传统的MHC抗原加工和提呈途径认为，MHCI类分子提呈的多肽来自细胞内抗原，而MHCII类分子提呈的是细胞外抗原。现已证实，DC也可以通过MHCI类分子途径提呈外源性抗原，启动MHCI类限制性的CD8+CTL反应和MHCII类限制性的CD4+Th细胞反应。

　　2　　树突状细胞的来源及体外扩增最初的研究所用的DC均由小鼠的脾获得，随后人们从小鼠的淋巴结、皮肤等处同样分离出DC，但是数量极少，难以开展实验研究。在正常情况下体内DC 含量极低。外周血单个核细胞中仅有0.5%～1.0%，动物脾脏单个核细胞中含0.5%～1.5%。在感染等条件下DC含量有所提高，肿瘤及肿瘤化疗、干细胞移植后则明显降低。20世纪90年代以来，体外培养诱导DC取得了巨大进步。Inaba等[4]应用GMCSF和IL4刺激小鼠骨髓细胞,获得了大量的DC。Bernhard等[5]用人骨髓CD34+前体细胞与GMCSF和TNFα共同培养，诱导出大量DC，此后人们将干细胞因子(SCF)和(或)Flt3 配体加入培养液，以增加DC产量。单核细胞是巨噬细胞和DC的共同前体，因此单加GMCSF可诱生出DC和巨噬细胞，而且以巨噬细胞为主。由于IL4可阻止单核细胞向巨噬细胞转化，因此联合应用IL4 后使DC 的量增加而巨噬细胞减少。Romani等[6]分离CD14+人外周血单核细胞在体外培养1～2 周，随后加入外源性GMCSF 和IL4,获得了大量形态及表型均类似DC的细胞，这种由单核细胞分化而来的DC，需在单核细胞条件培养液中持续培养，否则将失去DC 表型，重新分化成单核细胞。2000年Fairchild等[7]以胚胎体为中介，联合应用GMCSF、IL3诱导小鼠胚胎干细胞分化形成了大量高纯度的DC，具有典型的DC形态及表型，同时具有强烈的激活同种异基因淋巴细胞的能力。2003年Senju等[8]等利用骨髓基质细胞OP3，单独应用GMCSF同样将小鼠胚胎干细胞诱导分化形成了DC。

　　3　　树突状细胞与肿瘤的关系DC是目前已知的功能最强大的专职抗原提呈细胞，能通过吞噬、胞饮等方式高效摄取低浓度抗原，并以抗原肽/MHC分子复合物的形式将其提呈给淋巴细胞，是促进T、B 淋巴细胞增殖的高效刺激因子[9]，因此DC被认为是机体免疫反应的始动者。作为专职的抗原提呈细胞，DC具有以下特点:(1)能高水平表达MHC 类分子;(2)可表达参与抗原摄取和转运的特殊膜受体;(3)能有效摄取和处理抗原然后迁移至T细胞区;(4)能活化未致敏T细胞;(5)抗原提呈效率高。DC参与机体抗肿瘤免疫的主要机制在于DC能够对肿瘤抗原进行有效的摄取加工，并且通过膜表面高表达的MHCI、II类分子将肿瘤抗原提呈给T细胞抗原受体(TCR)，从而激发产生出大量针对该肿瘤的特异性CTL。而且DC 与T 细胞结合后可分泌大量的IL12，IL12有强有力的诱导T、NK、LAK细胞产生大量TNFγ、穿孔素和颗粒酶，增强CTL、NK对靶细胞的溶解作用。然而由于肿瘤患者体内的DC不仅数量减少而且功能上也存在严重缺陷，因此不能有效提呈抗原，激发特异性CTL反应，从而导致肿瘤不能得到很好的控制。有研究发现，肿瘤或者基质通过产生可溶性因子(如IL6 、IL10 、GMCSF)和使成熟的DC局限化来阻止DC1的功能表达及其分化，例如，肿瘤病灶中浸润性DC(TIDC) 并不能产生有效的免疫反应。Heseker等[10]指出，与正常的DC相比，TIDC缺乏刺激T细胞增殖及产生细胞因子的能力，其中89%～97%的TIDC不表达共刺激信号B7，而且已知的可刺激B7产生的细胞因子(如GMCSF、IL4 或TNFα)对TIDC表面B7的表达无效。DC表面B7表达的降低可能正是DC无法有效激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的原因，也是肿瘤免疫逃逸的机制之一。亦有研究发现，多数的人类癌细胞本身表达B71，而周围间质中有B71+ DC存在，这可能预示着在肿瘤中DC的提呈抗原的功能发生了缺陷[11]。Gabrilovich等[12]直接分离32例乳腺癌患者和14例健康人外周血中DC，观察DC对异体T细胞的刺激激活能力，用以评价其抗原呈递功能。结果发现与健康人DC 刺激活性相比，中晚期乳腺癌患者DC的刺激活性显著降低(P<0.05)，提示DC 功能与患者的临床经过密切相关。

　　4　　以树突状细胞为基础的肿瘤疫苗的制备

　　4.1　　肿瘤抗原(TAA 或TSA) 负载DC　　这是最常用的负载DC的方法，抗原获得可直接由肿瘤细胞提取纯化[13]或经弱酸洗脱，亦可以由cDNA、mRNA 通过基因工程的方法合成肿瘤细胞抗原。体外抗原肽负载DC回输后可引导特异性免疫反应，但半衰期相对较短。Schott等[14]用降钙素和癌胚抗原(CEA)肽负载单核细胞来源的成熟DC，并以(2～5)×106密度皮下注射重复免疫转移性甲状腺髓样癌患者，平均13.1 月后，所有患者都产生了由于血管周围和上皮CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞浸润引起的对肽特异的迟发型超敏反应(DTH)，3/7患者血清中肿瘤标记物降钙素和CEA浓度下降，1例患者肝转移灶完全消退，肺转移损害明显减轻，表明用降钙素或CEA肽负载DC免疫对部分患者有效。但该形式的疫苗有几个缺点限制了其应用：(1)负载在DC上的肿瘤抗原肽存在时间很短[15];(2)必须明确肿瘤抗原肽的HLA 类型;(3)肿瘤基因变异很快，易产生抗原损失逃逸突变[16]。

　　4.2　　全细胞性肿瘤抗原负载DC　　鉴于目前大多数肿瘤缺乏明确鉴定的TAA或TSA，且已知的多肽抗原不一定能在体内诱导出最佳的抗肿瘤免疫反应，用单一肽免疫不易打破免疫耐受，而以肿瘤细胞及其溶解物作为肿瘤抗原负载DC可以提供多种抗原表位供DC识别，利用DC加工提呈抗原的能力来完成对肿瘤抗原的选择，更适于临床应用。目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法和加热法等。DeMatos等[17]使用B16黑色素瘤或MCA106纤维肉瘤裂解物制备DC疫苗，免疫肿瘤模型鼠，可使荷瘤鼠体内的肿瘤消失，在预防模型组该疫苗能显著抑制肿瘤生长。Schnurr等[18]研究发现，采用200Gγ照射或43 ℃水浴2 h，所得到的凋亡胰腺肿瘤细胞作为肿瘤抗原负载DC较冻融抗原更易激发抗肿瘤免疫应答反应。用完全肿瘤细胞抗原刺激DC同样存在以下问题：需要大量的瘤体组织;肿瘤细胞蛋白提取物中成分复杂，其中包括机体的某些正常抗原，免疫机体后存在诱发自身免疫性疾病的潜在危险。

　　4.3　　肿瘤细胞与DC 融合　　肿瘤细胞与DC 融合后，该融合细胞兼有DC和肿瘤细胞的表型，可通过MHCI类和MHCII类途径提呈抗原，能激活CD4+和CD8+T细胞，诱导出特异性的抗肿瘤免疫。融合细胞较抗原冲击DC加工和提呈抗原的持续时间长，因而免疫作用更持久。将人MCF7乳腺癌细胞株与乳腺癌患者的CD14+ 来源的DC融合，融合细胞作用于自身T细胞,引起T细胞增殖，而单纯肿瘤细胞、DC或DC与肿瘤细胞的混合物均不能使T细胞增殖。融合细胞可杀伤51Cr标记的自身肿瘤细胞，并被MHCI单抗所阻断，证明此杀伤作用为MHCI限制性[19]。将卵巢癌细胞与自身或同种异体的DC 融合，融合细胞表达CA125 抗原、共刺激分子和粘附分子，诱导的CTL 也以MHCI限制方式杀伤自身肿瘤细胞[20]。Liu等[21]报道将相对成熟的DC(RMAT)与野生型J558 骨髓瘤细胞融合后生成DC(RMAT) /J558 杂交疫苗,免疫C57BL/6小鼠，有3/10小鼠产生了保护性抗肿瘤免疫应答，可抵抗1×106 J558骨髓瘤细胞的攻击，而用不成熟的DC(I2MAT)融合生成的疫苗则未见保护作用。这表明在应用细胞融合制备肿瘤疫苗时，诱导DC分化成熟极为重要。用电融合技术将小鼠乳腺癌细胞与同种异体的DC 融合，融合细胞表达肿瘤抗原并具DC的共刺激能力，显示了与聚乙二醇法融合相同的免疫效应。因而电融合同样也是制备融合细胞疫苗的有效方法[22]。

　　4.4　　基因修饰DC　　对DC进行基因修饰可增强DC诱导的抗肿瘤作用。目前修饰DC的基因主要有两类：肿瘤抗原基因和细胞因子基因。DC经抗原致敏后可以有效地将抗原提呈给T 细胞，而将编码该蛋白的基因导入DC并使其表达，也能激发特异性的抗肿瘤免疫反应，且有效提呈抗原的时间更长。研究证明，肿瘤抗原基因修饰的DC比肿瘤抗原蛋白或多肽体外致敏的DC诱导T细胞免疫应答的效果好。Frolkis等[23]把人的端粒酶反转录酶( human telomerase reverse transcriptase , HTERT)基因插入质粒和腺病毒，转染(化)DC疫苗不同程度地激起了T细胞反应，而且用腺病毒作为载体的DC激起的CTL反应效率更高。由于细胞因子在DC对T细胞提呈抗原过程中的重要作用，将细胞因子(GMCSF、IFNα、IL12、IL7)基因转入DC 以提高DC 活性，成为对DC 进行基因修饰的又一重要选择。经细胞因子基因修饰后的DC 增殖能力明显增强，并可诱导强的抗肿瘤免疫反应。将淋巴细胞趋化因子(lymphotactin,Lptn)基因与黑色素瘤相关抗原gp100基因共转染小鼠骨髓来源的DC，以此免疫小鼠，可以明显增加IL2和IFNγ的分泌量，增强CTL和NK细胞的细胞毒性，有效抵抗B16黑色素瘤细胞攻击。此疫苗免疫B16荷瘤鼠后，肿瘤组织出现明显坏死和炎症细胞浸润，可以有效抑制肿瘤生长，显示了比单纯转染Lptn、gp100或未修饰DC更强的免疫效应[24]。Natsuyoshi[25]将OVA特异性抗原基因与(secondary lymphoid tissue chemokine，SLC)、(monokine induced by IFNgamma，Mig)和Lptn共同导入小鼠胚胎干细胞，并在体外诱导其分化为DC，该DC无论在体外还是体内均显示强大的CTL活性。

　　5　　DC疫苗的应用途径DC疫苗在应用时必需使其与T细胞相互作用，活化T细胞生成肿瘤特异性的CTL，从而产生强大的抗肿瘤效应。研究发现，体外制备的DC疫苗在回输到体内后仍可以在趋化作用下选择性的进入淋巴组织。DC疫苗的应用途径通常包括皮下注射、静脉注射、腹腔注射、淋巴结内注射和肿瘤内注射等，不同的应用途径导致DC在体内进入淋巴组织的方式各异，其疗效也不尽相同。Okada等[26]将卵清蛋白冲击的小鼠DC 经不同的途径免疫荷瘤小鼠，结果皮内注射及皮下注射者有75%肿瘤完全消退，而腹腔内注射者效果较差。DC疫苗淋巴结内注射可能会增加DC与T细胞的接触，有利于诱导保护性抗肿瘤免疫。Lambert等[27]将肿瘤细胞裂解物负载的小鼠DC分别行腹股沟淋巴结注射、皮下注射及静脉注射，淋巴结内注射者免疫效应较其余二者均强，提示淋巴结内注射可作为DC疫苗的有效可行的途径。

　　6　　DC疫苗在临床上的应用随着人们在DC抗肿瘤方面做了大量的工作，其临床应用方面潜在价值越来越突显出来。Hus 等[28]最先报道肿瘤抗原负载DC能引起肿瘤特异性的T细胞反应及其临床疗效。4例滤泡状淋巴瘤患者经药物动员外周血后，分离纯化外周血DC，用淋巴瘤表达的单克隆抗体(独特性蛋白)负载DC并与负载了能被T细胞识别的匙孔嘁血蓝(KLH)的DC共同回输，结果4例患者均建立了较强的体液免疫及细胞免疫，其中有1例肿瘤完全消退，1例肿瘤部分消退，1例临床症状完全消除。Heiser等[29]采用自体前列腺癌特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)RNA转染DC 诱导CTL治疗晚期前列腺癌，其I期临床实验证实，PSAmRNA转染DC治疗晚期前列腺癌安全、有效;II期临床研究结果显示，治疗的13例患者中6例PSA直线下降，3例在分子水平上证实，循环中的肿瘤细胞被清除。Kugler等[30]采用电融合技术将自身肿瘤细胞与同种异体DC 融合，产生融合细胞表达肿瘤抗原并具有DC的共刺激能力，采用这种瘤苗对17例晚期肾癌患者进行治疗，结果其中有4例完全缓解，2例部分缓解。4例完全缓解的患者中3例在注射2次后病灶消退，直至第21个月仍未检测到肿瘤的复发或转移。杂交瘤苗注射后典型的表现为第1次注射后的1周内肿瘤开始缩小，转移灶消失;但对大面积病灶患者效果相对较差。此外，DC疫苗在胃肠道肿瘤、宫颈癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗方面也同样取得了较好的效果[31～35]。

　　7　　存在的问题及展望由于DC细胞在抗肿瘤免疫方面发挥着极其重要的作用，因此以DC为基础的肿瘤疫苗的研制及临床研究也成为当今生命科学研究的热点之一。但是DC疫苗在具体应用上也存在一系列的问题: (1) 被修饰的DC 及人体的回输技术要求高;致敏DC 的抗原的纯度、剂量、免疫途径、免疫次数间隔时间尚未明确。过量回输导致T细胞耗竭而致免疫功能下调或引起自身免疫性疾病。(2) 体外扩增诱导DC的性质、抗原提呈能力是否发生变化及对治疗结果的影响尚需进一步明确。Ludewig等[36]以肿瘤和正常组织都表达的共同抗原负载DC免疫小鼠，在诱导排斥肿瘤反应的同时伴有致死性的自身免疫性疾病发生，表现为糖尿病和动脉炎、心肌炎及扩张型心肌病等，虽然目前DC疫苗临床试验未见严重的自身免疫疾病，但同样值得高度重视。然而我们也应该乐观地看到，尽管DC疫苗在临床应用方面还存在一定的局限，但其实验研究方面国内学者已经作了大量的工作，相信以DC为基础的免疫治疗会有广阔的临床应用前景。

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