Cyclin D_1在颅脑胶质瘤中表达及细胞周期表达模式的研究
发表时间：2012-04-18 浏览次数：470次
叶元胜 詹仁雅 童 鹰
作者单位:325604 浙江省乐清市第三人民医院(叶元胜)
310003 浙江大学医学院附属第一医院(詹仁雅 童鹰)
【摘要】 目的 研究颅脑胶质瘤中cyclin D1的表达和细胞周期表达模式,探讨其与胶质瘤恶性程度的关系,并从生物学功能上探讨Cy2clinD1在胶质瘤细胞周期演进中的作用。 方法 采用免疫组化法检测52例胶质瘤标本中cyclin D1 的表达,观察其与胶质瘤恶性程度之间的关系;利用流式细胞仪双参数法和细胞同步化,确定 CyclinD1在胶质瘤细胞系SHG- 44和BT - 325中的细胞周期表达分布模式。 结果 Cyclin D1的表达随病理等级的递增而增高,高恶性度组阳性率和标记指数明显高于低恶性度组( P < 0. 05) 。在胶质瘤细胞系 SHG- 44 和BT - 325中,CyclinD1的表达呈细胞周期依赖性。 结论 cyclin D1在人脑胶质瘤细胞中过度表达,同肿瘤的发生、发展有密切联系;在SHG-44和BT - 325胶质瘤细胞中 CyclinD1的表达呈细胞周期依赖性。
【关键词】 细胞周期素D 免疫组化 胶质瘤 细胞周期
【Abstract】 Objective To investigate the expression and expression model of cyclin D1 in human glioma and reveal their relationships with pathological malignancy grades and elucidate biological function of cyclin D1 in the progression of cell cycle. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of cyclin D1 in 52 glioma cases in order to reveal their relationships with pathological malignancy grades. Cyclin D1 expression model in glioma cell line SHG- 44 and BT - 325 was analysed by using double parameter flow cytometry and cell synchronization. Results Marked overexpression of cyclin D1 was observed in gliomas. Expression of cyclin D1 increased with advancing malignancy grades. Positive rates and labeling indices in higher malignancy grades were significantly higher than those in lower malignancy grades ( P < 0. 05) . Double parameter flow cytometry of SHG- 44 and BT - 325 showed that Cyclin D1 expression was manifested as cell cycle dependent manner and oscillated with cell cycle. Conclusion Cyclin D1 are over - expressed in human gliomas and closely related to oncogenesis and progression of gliomas. The expression of Cyclin D1 in SHG- 44 and BT - 325 manifested as cell cycle dependent manner and periodical oscillation with cell cycle.
【Key words】 Cyclin D Immunohistochemistry Glioma Cell cycle
胶质瘤是最常见的颅内肿瘤 ,占中枢神经系统肿瘤的40 %以上 ,据国内统计 ,其5年生存率仅为38 %1。本研究采用免疫组化方法对胶质瘤中细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)表达进行检测 ,观察Cyclin D1 表达与其恶性程度的关系。并利用流式细胞仪双参数分析法结合细胞周期同步化,研究 Cyclin D1 在国内胶质瘤细胞系 SHG- 44和BT- 325中的细胞周期表达模式。
1 材料和方法
1.1 材料 (1)标本及细胞:52 例胶质瘤标本取自浙江大学医学院第一附属医院病理科保存的1999 至 2003 年切除的手术标本。星形细胞瘤32例 ,少突胶质细胞瘤6例 ,室管膜瘤7例 ,多形性胶质母细胞瘤 7 例。按 WHO 分级标准(1993) : Ⅰ级 9 例 , Ⅱ级 15 例 , Ⅲ级 17 例 , Ⅳ级 11 例。6 例正常对照取自脑外伤患者行急性内减压术的脑组织。细胞系: ①乳腺癌阳性对照细胞系MCF - 7 ,该细胞 Cyclin D1 蛋白阳性。② SHG- 44 胶质瘤细胞系:培养于生长培养基为1640 + 15 %FCS ,细胞呈上皮样,贴壁生长。③ BT - 325 胶质瘤细胞系:培养于生长培基为DMEM+ 15 %FCS ,细胞呈上皮样 ,贴壁生长。(2)试剂:小鼠抗人 Cyclin D1 单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司;SABC试剂盒(鼠抗人/兔抗人)购自武汉博士德生物技术公司。Nocodazole (Sigma) ,鼠抗人 IgG单克隆抗体(Sigma) 。FITC 标记的羊抗鼠抗体(Sig2ma) ,DCS - 6 (Novocastra 公司) 。
1.2 方法 (1)免疫组织化学方法:参照试剂盒说明操作; (2)细胞周期同步化和流式细胞双参数分析。
1.3 结果判断 以细胞核出现棕黄色染色为阳性。胶质细胞瘤中阳性染色例数的比例为该病理等级的阳性率(PR) 。每张切片取阳性细胞密集区 5 个以上高倍视野,光镜下观察1000 个细胞,平均每 100 个细胞中阳性染色数目为平均标记指数(MLI) 。
1.4 统计学处理 数据用( x ±s)表示,采用非参数检验方法处理数据。
2 结果
2.1 Cyclin D1 在胶质瘤中的表达 Cyclin D1 在正常脑组织和胶质瘤标本中均存在胞核阳性反应,阳性细胞散在分布,胞核略偏大,染色深浅不一(见图1、 2) 。正常脑组织中Cyclin D1 的 PR和 MLI分别为 25. 0 %和(0. 51± 0. 98) ,明显低于胶质瘤( P < 0. 05) 。35 例胶质瘤标本中出现阳性细胞,占总标本的 55. 8 %。不同病理等级的PR差异显著( P < 0. 05) 。胶质瘤MLI随着病理等级增高而明显升高( P < 0. 05) ,其中 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级与 Ⅳ级( P < 0. 01) 、以及 Ⅰ级与 Ⅲ级之间差异显著( P < 0. 05) 。高恶性胶质瘤的PR和MLI均明显高于低恶性肿瘤( P < 0. 05)见表1。
2.2 建立流式细胞仪双参数法 流式细胞仪双参数法可以同时分析一个细胞中的DNA含量及蛋白质含量。以乳腺癌细胞系MCF - 7为阳性对照 建立流式细胞仪双参数法,见213 确定 CyclinD1 在 SHG- 44 (和BT - 325)中的表达呈细胞周期依赖性 利用流式细胞仪双参数法,由 DNA水平分析可见,细胞停滞在 M 期 ,此时 G 1 期细胞仅为 1. 9 %(7. 8 %) ,随着培养时间增加,细胞同步进入 G 1 期 ,4h 左右达到峰值84. 2 %(12h左右达到峰值58. 5 %) ;随着部分细胞进入 S 期 , G 1 期细胞数呈逐渐下降趋势, 16h 降至峰底28. 2 %(24h降至峰底 22. 7 %) ,当部分细胞完成细胞周期,再次进入 G 1 期 ,G 1 期细胞又呈上升趋势。结合蛋白质水平分析可见,随着培养时间增加,CyclinD1 的表达量也逐渐增加 ,于4h左右达到峰值,与 G 1 期细胞数达到峰值的时间一致(图 3) [较 G 1 期细胞数达到峰值时间早(图 4) , 部分细胞逐渐进入 S 期后, Cy2clinD1 的含量呈下降趋势。随着部分细胞完成细胞周期, Cy2clinD1 的量也出现波动 ,提示 CyclinD1 蛋白质的表达不但呈细胞周期依赖性,且与细胞周期行进有关。同时实验结果显示: SHG - 44(BT - 325) 刚脱离同步化条件时, G 1 期细胞仅为 1. 9 %(7. 8 %) ,但此时 ,CyclinD1 的蛋白表达量却异常的高,达到102(相对值为0. 80) ,这提示 CyclinD1 在胶质瘤细胞进入 G 1 期的早期发挥重要的生物学作用。
3 讨论
3.1 正常脑组织中 Cyclin D的表达 本实验发现,正常脑组织中脑细胞无 Cyclin D1 表达 ,而周围胶质细胞出现少量Cyclin D1 弱阳性染色,其 PR和MLI分别为25. 0 %和(0. 51±0. 98) 。这与王存祖的结果基本一致2。脑细胞Cyclin D1 表达的缺失与其无分裂增殖能力相符合。少量胶质细胞Cy2clin D1 阳性染色可能表明胶质细胞具有潜在的增殖能力。
3.2 Cyclin D1 在胶质瘤中的表达 Sallinen3等采用 FISH、原位杂交和免疫组化的方法,对 Ⅱ～ Ⅳ级星形细胞瘤进行检测,发现 CyclinD1 在各级星形细胞瘤均有较高表达,并以Ⅳ级的表达水平最高,与 Ⅱ～ Ⅲ级星形细胞瘤相比差异有显著意义;同时还证明 CyclinD1 的过表达与肿瘤的增殖活性和侵袭力密切相关。但是, Numa4等报道在对 T98G、U373MG和U251MG3株胶质瘤细胞系 Cyclin D1 蛋白表达的研究中,未发现表达增高的现象。可见,胶质瘤中是否存在Cyclin D1 的过表达现象尚有一定争议。本实验发现,脑胶质细胞瘤中 Cyclin D1 的阳性率和平均标记指数(MLI)分别为 55. 8 %和(12. 75 ±14. 54) ,明显高于正常脑组织中( P < 0. 05) 。随着胶质细胞瘤恶性程度的增高,Cyclin D1 的表达水平升高。低恶性度组(WHO Ⅰ～ Ⅱ级)的MLI为(3. 50 ±6. 37) ,而高恶性度组(WHO Ⅲ～ Ⅳ级)为(20. 68± 14. 95) ,明显高于低恶性度组( P < 0. 05) 。这证实 Cyclin D1 在胶质瘤的发生、发展中发挥了重要的促进作用。由于大多数正常组织中 Cyclin D1 蛋白水平较低,甚至在一些增殖活性高的细胞中,免疫组化染色很弱,而在大约50 %的肿瘤中呈阳性染色,并且在许多原发肿瘤中,Cyclin D1的过度表达同肿瘤的恶性程度和患者预后均紧密相关,所以有人认为Cyclin D1有可能成为一种重要的临床诊断指标5。
3.3 Cyclin D1 在胶质瘤细胞中表达分布模式 肿瘤的细胞周期研究表明:各种致瘤因素最终导致细胞周期紊乱,细胞增殖异常,所以,肿瘤是一种细胞周期病6。D型周期蛋白,包括D1、 D2和D3三个亚型。CyclinD1 定位于 11q13 ,已被证实是与肿瘤最直接相关的瘤基因,是肿瘤细胞 G 1 期行进必不可少的蛋白质之一。D型周期蛋白在不同的细胞类型中表达模式不同,所发挥的生物学功能也不相同。利用流式细胞仪双参数法和细胞同步化,研究 CyclinD1在 SHG- 44和BT- 325 中的细胞周期表达分布模式,在同步化的 SHG- 44和BT- 325 中 ,CyclinD1 的表达呈细胞周期依赖性: 在 SHG- 44中 , CyclinD1 在 G 1 期表达最高,4h左右达到峰值, S期及 G 2/M期下降,但仍可检测到;在BT - 325中 ,CyclinD1 在 G 1 期表达最高,6h左右达到峰值, S期及 G 2/M期下降,但仍可检测到。研究结果显示:CyclinD1 在 SHG- 44和BT- 325中均有过表达,提示 CyclinD1 的过表达与胶质瘤细胞的恶性增殖有关,在胶质瘤癌变过程中发挥重要的作用。CyclinD1 在 SHG- 44 和 BT - 325 中的表达呈细胞周期依赖性,且与细胞周期行进密切相关。
参考文献
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