莪术油对人乳腺癌MCF7细胞凋亡及Bcl2、Bax表达的影响

　　作者：杨丽华 姜 杰 作者单位：厦门大学医学院 厦门 361005 福建省厦门市卫生局

　　【摘要】 目的：观察中药提取物莪术油(zedoray turmeric oil)对人乳腺癌(human breast cancer)细胞系MCF7的凋亡诱导作用。方法：用不同浓度的莪术油对体外培养的MCF7细胞进行干预。分别采用MTT、细胞免疫组织化学染色、流式细胞仪检测等方法，观察其对MCF7细胞增殖的抑制和凋亡诱导作用，并对凋亡相关Bcl2与Bax蛋白的表达变化进行定性检测。结果：经不同浓度的莪术油处理后的MCF7细胞，其生长受到明显的抑制，细胞凋亡指数随药物浓度增加而明显增加;莪术油作用后，细胞中Bax蛋白表达明显高于对照组。结论：一定浓度的莪术油能抑制MCF7细胞增殖，促进其凋亡;其机制可能与调控Bcl2、Bax 表达有关。

　　【关键词】 乳腺癌 莪术油 MCF7细胞 Bcl2 Bax

　　Abstract Objective:To investigate the effects of Zedoray Turmeric Oil on inducing apoptosis of MCF7 cells and to explore the possible mechanism of its action.Methods:Different concentrations of Zedoray Turmeric Oil were used in the culture system of MCF7 cells.Proliferation and apoptosis of MCF7 cells were observed by ways of MTT,immunocytochemistry,and flow cytometry quantitative analysis.The expression of Bcl2 and Bax protein was determined by qualitative analysis.Results:Proliferation of MCF7 cells was inhibited effectively after being treated by different concentrations of Zedoray Turmeric Oil.The rate of apoptosis increased as the increase in the concentration of Zedoray Turmeric Oil.The expression of Bcl2 was decreased in the experimental groups,whilethe expression of Bax protein was significantly higher than that the control group.Conclusion:Zedoray Turmeric Oil can effectively inhibit proliferation of and promote apoptosis of MCF7 cells; the mechanism may be correlated to the up regulation of Bax and down regulation of Bcl2.

　　Key words breast cancer Zedoray Turmeric Oil MCF7 Bcl2 Bax

　　莪术是我国传统中药之一， 是姜科草本植物莪术、 郁金的根茎， 味辛、 苦， 性温， 归肝、 脾经， 具有行气破血、 消积止痛的功效。 莪术油(zedoary turmeric oil)是莪术中提取的挥发油， 含有多种抗肿瘤有效成分。 对多种实体肿瘤(如子宫内膜癌、 宫颈癌、 白血病、 肺癌、 肝癌、 结肠癌、 乳腺癌等)有较强的抑制作用[1]， 而且具有抗血栓、 抗病毒、 抗菌和增强免疫等功能[24]。 张瑾峰等[5]发现， 莪术与三棱联合应用具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。 本研究通过一定浓度的莪术油作用乳腺癌细胞系MCF7后， 观察其对MCF7细胞的凋亡诱导效应， 并通过对与凋亡相关的Bcl2和Bax蛋白表达变化的检测， 探讨莪术油对MCF7细胞凋亡诱导的作用机制。

　　材料与方法

　　1.1 材料及仪器

　　人乳腺癌MCF7细胞株(厦门大学生命科学学院提供)。莪术油注射液(徐州莱恩药业有限公司，国药准字：H20067076)，配制为20g/L的无菌溶液备用。RPMI 1640、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。鼠抗人Bcl2、Bax单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。流式细胞仪(美国GENE公司)。实验时选用对数生长期细胞。

　　1.2 MTT法生长曲线测定

　　取对数生长期的MCF7细胞，消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104 个/ml， 接种于96孔培养板上，每孔加200μl细胞悬液，培养24小时后，加入不同浓度的莪术油(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)，另设对照组(不加莪术油)和空白对照组(只加培养基)，每组设 7个复孔，分别于加药后1、2、3、4、5、6、7、8和9天时加MTT(5mg/ml)20μl，孵育4小时后，加入二甲基亚砜200μl，避光振荡10min，酶标仪在570nm处测定各孔吸光度(OD)值，取平均值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

　　1.3 流式细胞仪检测凋亡

　　不同浓度的莪术油(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)分别作用于贴壁生长的MCF7细胞72小时后，胰酶消化，吹打脱落，使细胞分散良好，1500r/min离心5min，弃上清，加 1×缓冲液200μl。各管中分别加入AnexinV 4μl和PI 5μl，用1×缓冲液将终体积配成250μl， 冰浴，上机检查。以不加莪术油培养72小时的MCF7细胞作为阴性对照。

　　1.4 免疫细胞化学染色

　　将对数生长期的MCF7细胞6瓶(细胞数>1×105/瓶)随机分为对照组和实验组， 每组3瓶。实验组用含0.35mg/ml莪术油的培养基培养，对照组正常培养，48小时后终止培养。随机从对照组和实验组各取1瓶细胞，用0.2%胰酶消化后收集细胞，做细胞涂片。4℃丙酮固定20min，1XPBS洗3次，每次5min。自然干燥后，按PV9000试剂盒要求，行Bcl2和Bax免疫细胞化学染色，并分别设立阴性与阳性对照。结果判定：Bcl2和Bax阳性细胞为胞质染为黄色或棕黄色，阴性细胞均不着色。通过染色强弱，观察两种蛋白表达改变的趋势。

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS18.0统计软件，计量资料用(±s)表示，t检验，P<0.05为显著性检验水准。

　　2 结 果

　　2.1 莪术油对MCF

　　7细胞形态变化的影响 实验组细胞在加药后24小时，倒置显微镜下观察，可见大部分细胞由梭形变为不规则形，胞体增大，胞内可见大小不等的空泡样结构，细胞核边移，但大部分细胞膜尚完整，尤以1.0mg/ml组细胞形态变化最明显，并且细胞数量与对照组比较明显减少，同时有许多细胞漂浮，不贴壁。

　　2.2 莪术油对MCF

　　7细胞生长的影响 根据酶标仪所测的不同时间及不同浓度莪术油作用后的 OD值绘制MCF7细胞生长曲线。从该生长曲线可见，MCF7细胞经5种不同浓度的莪术油处理后，细胞生长受到不同程度的抑制，以1.0mg/ml组的抑制作用最强，见图1。图1 MCF7细胞生长曲线2.3 对细胞凋亡率的影响 不同浓度(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)的莪术油作用于MCF7细胞72小时后，上机检测，流式细胞仪作出细胞DNA含量分布图，计算机软件自动拟合出凋亡指数(%)。对照组凋亡指数为4.53%， 实验组分别为10.17%、17.10%、23.15%、26.43%和30.12%。随药物浓度增加，细胞凋亡指数呈上升趋势。

　　2.4 细胞免疫组织化学染色结果

　　Bcl2染色显示，对照组细胞浆浓染呈棕黄色，实验组细胞浆着色明显减弱，呈淡黄色，个别细胞甚至呈阴性。Bax染色显示，对照组细胞浆染色呈淡黄色，实验组细胞浆着色则明显增强，尤以核周明显，黄染加重。

　　3 讨 论

　　文献报道[1]，一定浓度的莪术油在体外可诱导人子宫内膜癌RL952细胞，肝癌SMMC7721细胞、胃癌NKM45细胞、肺癌SPCA4细胞和肝癌细胞HepG2细胞凋亡，且其诱导凋亡的作用随莪术油的浓度增加而增加。蒲磊等[6]研究表明，莪术油可抑制乳腺癌MCF7细胞增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与上调Fas蛋白、下调FasL蛋白表达有关。

　　本研究用0.15～1.0mg/L的莪术油作用乳腺癌细胞株(MCF7)1～8天后，细胞生长受到不同程度的抑制。从MTT的实验结果看，0.15mg/ml浓度的莪术油对MCF7细胞的增殖抑制作用不明显，而0.35mg/ml及更高浓度的莪术油则可使细胞增殖受到明显抑制，且随着作用浓度的增高和作用时间的延长，细胞增殖受抑制更为明显，提示莪术油对MCF7细胞的增殖有抑制作用，而且呈时间和浓度依赖性。用不同浓度的莪术油分别作用 MCF7细胞72小时后，细胞凋亡率检测发现，在药物浓度为0.35mg/L，即有明显的细胞凋亡发生，随药物浓度的增加，细胞凋亡率呈上升趋势;并且在药物浓度为0.35mg/L时， 凋亡率已达23.15%。由此提示，莪术油在体外具有抑制MCF7细胞生长增殖、诱导凋亡的作用，且这一作用随药物作用的浓度增加而增加。根据生长曲线计算，莪术油对MCF7细胞的半数有效量在0.325mg/L左右。研究结果显示，莪术油能下调MCF7细胞的Bcl2表达，同时上调Bax的表达，两种蛋白比例发生明显变化。结合细胞凋亡率检测结果推测，莪术油诱导MCF7细胞凋亡可能与其改变凋亡相关蛋白Bcl2/Bax的表达有关。

　　以上结果提示,莪术油在体外对MCF7的生长增殖有明显抑制作用，同时诱导该细胞凋亡，有可能是一种有希望的抗肿瘤中药。其作用机制可能与莪术油调控MCF7细胞的凋亡相关基因Bcl2/Bax的表达有关，而不是单纯的细胞毒性坏死。

　　【参考文献】

　　[1] 方刚,肖夏清.莪术油抗肿瘤的临床应用及实验研究进展[J].广西中医学院学报,2009,12(01)：6163.

　　[2] 叶寿山,盛晓蓉.莪术油软胶囊抗病毒作用研究[J].中药药理与临床,2005,21(3)：2022.

　　[3] 徐立春,边可君.天然药物莪术醇抑制肿瘤细胞生长及RNA合成影响的初步研究[J].肿瘤,2005,25(6)：570572.

　　[4] 曾建红,陈旭.莪术醇的研究进展[J].中药材,2008,31(1)：168169.

　　[5] 张瑾峰,王喆,刘欣,等.莪术、三棱和白介素-6对人乳腺癌细胞凋亡的诱导作用[J].首都医科大学学报,2006,27(4)：492493.

　　[6] 蒲磊,赵树鹏.莪术油对人乳腺癌MCF7细胞增殖及凋亡的影响[J].中国新药与临床杂志,2009,5(28)：376379.