深低温停循环不同时间点犬脑皮质半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3 mRNA的表达

　　作者：茹江江,邹小明,吴华,王武军　　作者单位：南方医科大学附属南方医院胸心血管外科，广东 广州

　　【摘要】 目的 利用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3 mRNA(Caspase-3 mRNA)在深低温停循环(DHCA)过程中的表达，探讨DHCA对神经细胞凋亡的影响，为深低温停循环后脑损害的研究和防治提供资料。方法 选择健康成年杂种犬10只，建立DHCA模型，分别于体外循环0 min、停循环0 min、停循环30 min、停循环60 min、复温再灌注45 min取脑皮质迅速冻存，待全部动物实验结束后统一行实时荧光PCR定量检测Caspase-3 mRNA的表达情况。结果 体外循环后特别是降温后Caspase-3 mRNA的拷贝数先下降，DHCA 0 min达最低值，随着DHCA过程的延长，Caspase-3 mRNA的表达逐渐增强，复温再灌注45 min达最大值，不同时间点Caspase-3 mRNA的拷贝浓度间差异有显著性意义(F=42.71，P<0.001)。复温再灌注45 min后Caspase-3 mRNA的拷贝数均显著高于此前各时间点(P<0.01)。结论 DHCA中随着缺氧的加重可诱导Caspase-3 mRNA的表达，随着DHCA时间的延长，Caspase-3 mRNA表达升高。复灌后表达达最高值。

　　【关键词】 深低温停循环;半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3 mRNA;实时荧光定量聚合酶链反应

　　基金项目：南方医科大学南方医院院长基金(编号：20050017)

　　Expression of Caspase-3 mRNA in canine pallium at different time points during profound hypothermic circulatory arrest　　RU Jiang-jiang，ZOU Xiao-ming，WU Hua，et al　　Nanfang Hospital，Nanfang Medical University，Guangzhou 510515，China

　　Abstract: Objective To analyze the expression of Caspase-3 mRNA in canine pallium at different time points during profound hypothermic circulatory arrest by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR),to probe the impact of DHCA to neurocytic apoptosis,and to provide data for reseaching and prevention of brain damage after profound hypothermic circulatory arrest.Methods Ten healthy adult hybrid dogs were obtained to make DHCA model.At the beginning (0 minute) of extracorporeal circulation establishment and circulatory arrest,30 minutes and 60 minutes after circulatory arrest,the cerebral cortex were obtained and frozen after rewarming followed by 45 minutes reperfusion.After all the animal experiments were finished,real-time fluorescence quantitative PCR was carried out to detect Caspase-3 mRNA expression.Results Caspase-3 mRNA copy number decreased first after the establishment of extracorporeal circulation,especially after hypothermia.DHCA reached its nadir at 0 minute.As DHCA process was prolonged，Caspase-3 mRNA copy concentration at different time point were significantly different(F=42.71，P<0.001).Caspase-3 mRNA level after 45 minutes of reperfusion was significantly higher than those of other time points(P<0.01).Conclusion With the aggravation of anoxia,DHCA can induce Caspase-3 mRNA expression.As DHCA process was prolonged,Caspase-3 mRNA expression level keeps increasing and reaches the peak level after reperfusion.

　　Key words: deep hypothermic circulatory arrest;cysteinylaspartate specific proteinase-3 mRNA;real-time polymerase chain reaction

　　缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)可导致神经细胞凋亡[1],并可出现多种凋亡相关基因表达[2]。深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)是主动脉弓等大血管手术中脑保护的核心技术，是保证手术完成及术后功能恢复的关键。本实验建立犬DHCA动物模型[3]，利用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，观察DHCA过程中犬脑皮质细胞半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3(cysteinylaspartate specific proteinase-3，Caspase-3) mRNA表达的情况，探讨DHCA对神经细胞凋亡的影响，为DHCA后脑损害的研究和防治提供资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　健康成年杂种犬10只，雄性7只，雌性3只，体质量13.5～15.5 kg，平均(14.70±1.03)kg，由南方医科大学实验动物中心提供。ABI 3900台式高通量DNA合成仪(美国ABI公司)，3005mx定量PCR仪(美国Stratagene公司)。

　　1.2 动物模型制备

　　所有实验犬行常规DHCA手术。以0.12 mol•L-1戊巴比妥钠诱导麻醉，气管插管，呼吸机辅助呼吸。左颈动脉插管测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)。右侧开颅取脑皮质。主动脉插管及上、下腔静脉插管建立体外循环转流降温至鼻咽部温18 ℃停循环。90 min后恢复循环、复温再灌注至鼻咽部温37 ℃后停机，停机60 min后放血处死实验动物。每只实验犬分别于体外循环0 min、停循环0 min、停循环30 min、停循环60 min、复温再灌注45 min取脑皮质约0.5 g，迅速冻存，待全部动物实验结束后统一行实时荧光PCR定量检测Caspase-3 mRNA的表达情况。

　　1.3 Caspase-3 mRNA的定量测定

　　利用GenBank资源，得到犬Caspase-3 cDNA序列(GenBank序列号NM 001003042)，应用引物设计软件Primer 5.0，得到犬Caspase-3 mRNA引物及探针：上游引物(Sense)：ACAGATTCCATGTATTGTGTCTATGC;下游引物(Reverse)：GGATCAGTTAAACCATTTCCTCACTT;探针序列(FAM)：ACCAAACCAAACCAAACCAACCCATCCATCT。利用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成Caspase-3 mRNA引物及探针。提取脑组织中的RNA行吸光光度值的测定。完成反转录反应及阳性标准模板的制备后行荧光定量PCR反应。反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。结果按copy number•μg-1 cDNA进行分析。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据应用应用SPSS 13.0统计软件包，对不同时间点Caspase-3 mRNA表达数据行重复测量方差分析。以P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　体外循环后特别是降温后Caspase-3 mRNA的拷贝数下降，随着DHCA过程的延长，Caspase-3 mRNA的表达逐渐增强，实验不同时间点Caspase-3 mRNA值(×105 copy number•μg-1)：体外循环0 min时3.46±1.84，停循环0 min、停循环30 min、停循环60 min、复温再灌注45 min分别为2.24±1.11、5.27±1.16、6.10±1.17、39.16±11.68，DHCA 0 min达最低值，复温再灌注45 min达最大值，不同时间点Caspase-3 mRNA的拷贝数间差异有显著性意义(F=42.71，P<0.001)。复温再灌注45 min Caspase-3 mRNA的拷贝数均显著高于此前各时间点(P<0.01)，体外循环0 min、停循环0 min、停循环30 min、停循环60 min 4个时间点Caspase-3 mRNA表达之间差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨论

　　细胞凋亡即程序化细胞死亡[4-5]，是机体生理性细胞死亡和在损伤因素作用下机体细胞死亡的一种具有特定形态特征的死亡形式[6]，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程[7-8]。任何能通过直接细胞损伤产生坏死的因素都可在存活下来的细胞中诱发凋亡，在这种情况下，细胞凋亡表现为对不能立即致死的有害刺激的应激反应[9]。细胞凋亡除在神经系统发育和维持免疫系统的正常功能中具有重要作用外，还参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程[10]。

　　Caspase家族是近年来新发现的一类半胱氨酸蛋白酶，迄今为止已发现14种，分别命名为Caspase-1～14[11],Caspase是参与和调控细胞凋亡的主要成分[12]，细胞凋亡主要由Caspase级联反应过程控制[13]，Caspase家族已被明确在细胞凋亡事件中起关键作用，与真核细胞凋亡密切相关[14]，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。它们切断目标细胞与周围细胞的联系，重组细胞骨架，使DNA复制和修复能力降低，阻断拼接，破坏DNA和核结构，诱导细胞释放吸引吞噬细胞的信号，使细胞解体形成凋亡小体。Caspase-3是Caspase家族中最重要的终末切酶，是细胞凋亡的关键蛋白酶,既作为起始物，接受凋亡信号，发生细胞内的级联反应，又作为效应物，水解各种成分，使细胞解体，形成凋亡小体[15-16]，一旦被激活，凋亡常难以避免，因此Caspase-3可能为最下游的凋亡执行蛋白，也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据[17]。

　　资料表明，HIBD的病理过程同时存在着坏死和凋亡[11]。本实验采用实时荧光PCR技术定量测定犬DHCA模型中脑皮质细胞Caspase-3 mRNA表达情况。首先于体外循环开始前测得基础表达值，即生理条件下Caspase-3 mRNA的表达，该表达可能与正常皮质细胞凋亡有关。随着体外循环开始、温度的下降，Caspase-3 mRNA的拷贝数逐渐下降，DHCA 0 min达最低值，说明此时细胞凋亡最少，与目前研究认为低温对HIBD有保护作用的结论相一致[18]。其机制可能与降低脑代谢、抑制兴奋型氨基酸的积聚和兴奋毒性、抑制自由基的生成有关。随着DHCA过程的延长，Caspase-3 mRNA的拷贝数缓慢上升，但无统计学差异。复温再灌注45 min时，Caspase-3 mRNA的拷贝数急剧升高，并显著高于此前各时间点，说明在整个体外循环及深低温停循环过程中，复温再灌注期是Caspase-3 mRNA表达最显著的时期，这也间接表明此时脑皮质细胞凋亡发生率最高。王爱枕等[19]报道新生大鼠HIBD后实验侧脑组织Caspase-3活性高于健康对照组，Wang等[20]亦证实新生鼠缺血缺氧后1 h患侧脑皮层Caspase-3活性显著升高(208%)，24 h达高峰(2546%)，6 d仍高(169%)。

　　目前研究表明，缺血再灌注后脑损伤中神经细胞死亡不是简单的坏死，而存在着Caspase-3等凋亡蛋白表达迅速增加与细胞核内小体分裂等复杂的细胞凋亡机制，这种病理情况下的凋亡可引起或加重脑损伤。DHCA过程可以看作是一种特殊的缺血再灌注过程。本实验表明，在体外循环及深低温过程时，Caspase-3 mRNA的表达处于较低水平;而复温再灌注后Caspase-3 mRNA表达急剧增强，也是脑皮质细胞凋亡显著增加的时段。能否在此时段给予相应的抑制剂阻断其病理过程可能成为下一步研究的方向。李小冰等[21]研究发现，高剂量硫酸锌可抑制移植术后心肌细胞Caspase-3的活化，从而降低其凋亡指数。尽管确切机制仍不十分清楚，但为DHCA脑损害的治疗提供了新的对策。

　　总之，关于DHCA神经元凋亡及其基因表达的研究，对进一步确定合理而有效的治疗方案、预防脑瘫及减少DHCA神经病变后遗症的发生将有重要意义。

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