造血干细胞移植后检出人类多瘤病毒尿的临床分析

　　作者：卢育洪,朱康儿,李扬秋,Siegert　　作者单位：广州, 暨南大学附属第一医院内科;暨南大学医学院血液病研究所;Medizinische Klinik II m.S. Onkologie und Hmatologie, Charité,Humboldt Universitat,Berlin,10117,Germany

　　【摘要】 目的 研究造血干细胞移植后潜伏于体内的人类多瘤病毒(HuPV)-BK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)的激活情况。方法 连续采集41例患者造血干细胞移植前后及10例正常对照的尿样本，用实时定量PCR检测病毒，半巢式PCR鉴定BKV和JCV病毒株。结果 造血干细胞移植后病毒尿阳性的患者共33例(80%)，其中出现BKV尿者15人(45%)、JCV尿者3人(9%)，在相同或不同时段尿样本中检出两株病毒者11人(33%)，另外4人(12%)未能鉴定出病毒株;比较24例病人移植前、后病毒尿发生率，分别为19%、77%，存在显著性差异(P<0.0001);正常对照组没有检测到病毒(P<0.0001)。结论 造血干细胞移植后HuPV病毒尿的发生率明显升高，但影响因素仍不明确，可能是多因素综合作用的结果，其临床意义还有待进一步探讨。

　　【关键词】 造血干细胞移植;BK病毒;JC病毒;PCR

　　Clinical Analysis in Patients with Human Polyomaviruses Urine after Stem Cell Transplantation

　　LU Yuhong, ZU Kanger, LI Yangqiu, Wolfgang SIEGERT

　　Division of Hematology, Internal Medicine, First Affiliated Hospital, Guangzhou 510632, China;Institute of Hematology, Medical College, Ji'nan University;Medizinische Klinik II m.S. Onkologie und Hmatologie, Charité, Humboldt Universitat, Berlin 10117, Germany

　　Abstract：Objective To study and profile human polyomavirus (HuPV) reactivation after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).Methods Continuously collected middlesteam urine samples from 41 patients with hematopoietic stem cells transplantation and 10 immunocompetent peoples as control group. HuPV DNA was detected with RealTime PCR and the stains of BK virus and JC virus were distinguished with seminested PCR.Results 33 of the 41(80%) patients shed viruria after HSCT. Of them, 15 (45%) cases shed BK viruria, 3 (9%) cases for JCV and 11(33%) cases embraced two viral stains that simultaneously or separately in the urinary specimens. The viral stains were not identified in 4 (12%) cases. Comparison in 26 patients with the initial specimens prior to transplantation subjects that the incidence of viruria is significant increased after HSCT (P<0.0001) .Conclusion The amount of patients shedding HuPV in urine is significantly increased after HSCT. The impact factors remain ambiguous and the associated clinical significance should be further explored.

　　Key words：Hematopoietic stem cell transplantation; BK virus; JC virus; PCR

　　0 引言

　　人类多瘤病毒(HuPV)，BKV、JCV和SV40病毒(恒河猴病毒)是没有囊膜的小DNA病毒，属乳多空病毒科，广泛存在于自然界。其中BKV、JCV与人类疾病密切相关。它们通过口腔、呼吸道或食物进入人体后，经淋巴细胞到达并潜伏在肾小管或尿道上皮细胞内。健康人群中病毒抗体阳性者占80%，国外报道用实时定量PCR方法BKV尿检出率为0%～1%、JCV约为28%[13]。在造血干细胞移植的患者，由于机体免疫功能受损，潜伏于体内的病毒可能被激活诱发相关的并发症，如出血性膀胱炎等，一定程度上影响了病人的生活质量甚至预后，目前国内在这方面的研究和相关报道甚少。

　　1 资料和方法

　　1.1 病例和样本收集

　　研究对象为2001～2003年期间接受异体造血干细胞移植病人共43例，男21例，女22例，平均年龄42岁(18～62岁)。诊断急性粒细胞白血病 15例、继发急性粒细胞白血病2例、 急性淋巴细胞白血病2例、慢性粒细胞白血病16例、侵袭型淋巴瘤3例，骨髓增生异常综合2例，再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤征各1 例。24例接受含大剂量环磷酰胺 (120mg或200mg)的标准预处理方案;19例接受非清髓预处理，部分人使用了小剂量环磷酰胺。20例接受骨髓移植， 23例接受外周血干细胞移植。亲缘供者11例，HLA位点全相合9例，1位点不合者2例;非亲缘供者32例，HLA位点全相合的及1位点不合者各16例。移植前巨细胞病毒(CMV)IgG 阴性患者18例，阳性患者25例，阴性供者22例，阳性供者21例。合并CMV相关疾病3例。预防移植物抗宿主病(GVHD)方案： 3例单用环孢素A， 36例联合环孢素A 和氨甲蝶磷, 4例环孢素A和骁悉。移植后合并急性GVHD 0～1级30例、2级以上13例。造血重建前粒细胞低于1×109/L的中位时间为20天(7～48天)，血小板少于20×109/L的中位时间为20天(6～392天)。

　　每周收集病人晨间第一次中段尿，分装后加入终浓度0.02%的叠氮钠防腐，置4℃冰箱保存，检测前用双蒸水1∶10稀释。

　　1.2 实时定量PCR检测人类多瘤病毒

　　采用美国PE Biosystem公司生产的ABI 7700 实时定量PCR仪，引物和荧光探针序列，定位于BKV(ACCESSION：J02038)或JCV(ACCESSION：J02226)基因组中VP1区，扩增产物大小分别为226bp和223bp,见表1。

　　PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5μl，MgCl2(50μM)1.5μl，dNTP(各250μM)，TE缓冲液0.4μl，ROX(荧光素)0.163μl(1μM)，引物各0.1025μl(500nM)，探针(100nM)0.25μl，PlatinumTaq 合酶0.2μl(2U)，检测尿样本2.5μl，加双蒸去离子水至25μl。94℃启动延续3min， 94℃ 30s;62℃ 30s，扩增45个循环。每一反应板都设空白样本、病毒质粒为阴、阳性对照，同一份标本重复测定，取平均Ct值，与标准曲线比较得出病毒浓度。

　　1.3 半巢式PCR鉴定病毒株

　　半巢式PCR第一轮反应中引物对BKV和JCV没有选择性，第二轮反应中下游引物具病毒株的特异性。

　　30μl的反应体系中，检测样本5μl，10×PBS液3μl;其他成分及终浓度为：引物333nM、dNTP 50μM，1U Taq DNA聚合酶。第一轮的反应条件：94℃启动3min，94℃ 20sec、53℃ 20sec、72℃ 5min进行30次循环。第二轮PCR以1μl第一轮反应产物作为模板，退火温度为58℃，进行45次循环。终产物采用1%溴乙啶琼脂糖凝胶电泳，BKV为246bp、JCV 199bp。

　　F: 6carboxyfluorescein attached to the 5' terminus (FAM); T: 5carboxytetramethylrhodamine (5TAMRA) attached to 5ethylaminodeoxythymidine; R: A/G，P: phosphate group attached to the 39 terminus.

　　1.4 病毒质粒或阳性标准品的制备

　　用QIAgen试剂盒纯化巢式PCR的阳性产物，根据TOPOTA(QIAGEN)试剂盒提供的方法，将病毒DNA片段通过接入TA质粒(pCR2.1TOPO，3.9kb)中，E.coli TOP10 菌株培养阳性克隆，提取其DNA为病毒阳性标准品。

　　1.5 统计分析

　　用SPSS统计软件进行数据分析。运用列联表、χ2检验或四格表Fisher检验等比较不同条件下病毒尿出现的概率，运用Mann-Whitney或KolmogorovSmirnov非参数检验比较病毒拷贝浓度的中位数，运用KaplanMeier方法分析临床相关因素对出现病毒尿的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 实时定量PCR的检测结果

　　由于2例病人的标本收集不符合要求，分析数据时被剔除。从41例病人共收集了534份尿标本。其中33例(80%)病人163份尿样本定量 PCR检测病毒阳性，病毒浓度范围4.6×104拷贝/L～3.4×1011拷贝/L。24例患者移植前收集到的26份样本，其中5位病人的单份样本检测到病毒，病毒浓度中位数为5.2×105拷贝/L;16例病人移植后出现病毒尿，病毒浓度中位数1.9×107拷贝/L，3例病人在移植前后均无病毒分泌。10位健康对照收集到的50份尿样本中没有检测到病毒。

　　2.2 半巢式PCR的检测结果

　　运用半巢式PCR对定量PCR阳性的标本进行病毒株鉴定，其中15例(45%)病人的99份样本中检出BKV(P<0.0001)，3例(9%)病人的32份样本中检测出单株JCV，11例(33%)病人的21份尿样本中同时存在BKV和JCV，4例病人的11份样本中虽然定量PCR阳性，电泳未出现预期的病毒DNA扩增条带。

　　M: marker; lane 1～7: from urine specimens of the patients, lane 8～10: negative controls (only Master Mix);lane 11: positive control (BKV)

　　2.3 造血干细胞移植患者排泄病毒尿的时序规律

　　5例病人从移植前开始分泌病毒，且1例分泌JCV者移植后没有再检测到病毒，其他28例在移植后第6～185天开始病毒分泌，其中17例第一次病毒尿出现在第3周，病毒浓度的高峰集中出现在第3～9周。

　　2.4 患者分泌病毒尿与临床因素的相关性分析

　　经统计学分析，结果没有发现BKV或JCV尿的出现与病人下列临床因素有关：性别、年龄、基础疾病、供/受者CMV感染血清学状态、供者来源、预处理方案、干细胞来源(骨髓/外周血)、GVHD预防方案、GVHD严重程度、移植后血液学重建时间。运用非参数统计学方法显示，上述临床因素对病人的病毒分泌峰值也无影响。但在3例出血性膀胱炎的病人中，病毒在尿样本中的峰值含量与其他患者相比存在统计学意义(P<0.043)。

　　3 讨论

　　由于实时定量PCR方法具备简单、快速、定量及安全性高等特点，已被越来越多地用于病原体的检测[4]。本文80%病人在干细胞移植后开始分泌病毒尿，病毒尿阳性的病例中45%只出现BKV，9%仅检出JCV，33%病人能检出两种病毒株―BKV和JCV：即两株病毒相同或不同时段出现在尿样本中。正常对照组尿中没有检出病毒，移植前只从少数病人尿中检到，这一结果提示移植后病人体内人类多瘤病毒可能被激活并分泌到尿中。由于所用的检测方法不同，病毒检出的敏感性不同，根据文献报道早期用ELISA法时，55%病人尿中检出BKV，7%病人中检出JCV[5];用竞争性定量PCR和巢氏PCR方法，71.4%的骨髓移植后病人尿中检出BKV，其中8.6%病人同时检出JCV;免疫正常对造组40%的人在尿中检出BKV，其中9.6%的人同时检出JCV[6];近年有学者运用实时定量PCR检测BKV，发现所有骨髓移植后病人尿中至少2次出现阳性结果，正常对照中只有40%出现弱阳性[7]。

　　虽然移植后人类多瘤病毒在患者尿中的检出率显著增高，但经统计学分析，病毒尿的出现及病毒浓度与以下临床因素不存在显著相关：性别、年龄、基础疾病、供/受者CMV感染血清学状态、供者来源、预处理方案、干细胞来源(骨髓/外周血)、GVHD预防方案、GVHD严重程度、移植后血液学重建速度等，结果与文献报道一致。

　　国外研究认为激活的BKV可能是移植一周后发生的出血性膀胱炎触发因素之一[6，7]，本组病人3例患者合并了出血性膀胱炎，他们的尿中BKV拷贝数高于其他无此合并症者，但均无分泌、没有JCV。

　　人类多瘤病毒在免疫功能低下的患者体内被激活，相关疾病的报道近年来渐受关注。如爱滋病患者合并JCV相关的进行性多灶性白质脑病(PML);肾移植后病人并发BKV相关性肾病，由此发展为暂时甚至永久性肾功能不全，是肾移植失败的原因之一[8，9]。人类多瘤病毒在造血干细胞移植后被激活，与移植后细胞免疫功能缺陷有关，后者也是移植后巨细胞病毒感染的一个重要原因，但其临床意义有待进一步探讨。

　　【参考文献】

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