人tumstatin基因的克隆表达及其鉴定

　　作者：颜廷　　作者单位：天津，中国医学科学院 中国协和医科大学 放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室

　　【摘要】 目的 重组表达人tumstatin，为人tumstatin的肿瘤受体显像奠定基础。方法 提取HEK293细胞总RNA，通过RTPCR扩增人tumstatin基因，导入pMD19T，测序，然后亚克隆至pET28a, IPTG诱导表达, 产物进行SDSPAGE分析和Western blot鉴定。结果 提取的总RNA经电泳，有清晰的28S和18S两条带。RTPCR扩增产物长度与理论值750bp相一致。测序证实 tumstatin基因正确插入载体中。重组人tumstatin在大肠杆菌中高效表达，表达量约占菌体总蛋白量的30%。Western blot证实所表达蛋白为目的蛋白。结论 重组人tumstatin蛋白在大肠杆菌中高效表达，为进一步的tumstatin的肿瘤受体显像奠定基础。

　　【关键词】 tumstatin 肿瘤新生血管生成抑制因子 因克隆和表达

　　1971年Folkman[1]提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管生成”的观点。通过抑制肿瘤新生血管生成，切断肿瘤的营养和氧气供给，抑制肿瘤细胞的生长和转移，成为近来肿瘤治疗上的新策略。tumstatin是一种新发现的源于胶原IV α3链C末端的肿瘤新生血管抑制因子，由244个氨基酸组成，分子量为28KD[24]。

　　近来研究表明，tumstatin可特异地抑制肿瘤血管内皮细胞蛋白的合成，导致内皮细胞凋亡，使新生血管合成受到抑制，从而抑制肿瘤生长、浸润和转移[4，5]。另外，tumstatin还具有直接作用于肿瘤细胞并抑制其增殖的特性。这些作用主要是通过tumstatin和肿瘤新生血管上特异高表达的整合素αvβ3结合来实现的[6,7]。αvβ3是近来研究较多的一个肿瘤新生血管上较理想的靶位点[8]，由于tumstatin具有与其特异的结合能力，通过用131I、99Tcm等放射性同位素标记tumstatin，进行肿瘤的放射受体显像，具有重要和潜在的临床应用价值。本研究利用RTPCR技术从HEK293细胞总RNA中合成了人tumstatin基因, 并实现了其在大肠杆菌中的高效表达，为进一步的肿瘤放射受体显像研究奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株、质粒和细胞 E.coli DH5α和BL21(DE3)由本实验室保存。pMD19T购自Takara公司。pET28a为本实验室保存。HEK293细胞由南开大学生命科学院杨洋同学提供。

　　1.1.2 试剂 Trizol试剂和SuperScript cDNA第一链合成系统购自Invitrogen公司。PCR试剂盒、pMD19T 试剂盒及Nco I和Xho I内切酶购自Takara公司。T4 DNA连接酶购自NEB公司。Anti-His抗体、羊抗鼠IgG-HRP购自天根生物公司。DAB显色试剂盒购自鼎国生物技术公司。

　　1.1.3 引物设计 根据GenBank中人tumstatin的基因序列，设计了如下一对引物。上游引物：5’CATGCCATGGGTTTGAAAGGAAAACGTGGAG3’，下游引物：5’CCGCTCGAGGTGTCTTTTCTTCATGCACAC3’，并在上游引物5’端和下游引物5’端分别引入Nco I和Xho I 酶切位点。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人胚肾HEK293细胞总RNA的提取 培养HEK293细胞至对数期，离心收集，计数，每小管约2×106个细胞，按Trizol试剂说明书提取总RNA。用分光光度法测定总RNA的纯度和量，通过电泳来鉴定RNA的完整性。

　　1.2.2 RTPCR扩增人tumstatin 基因

　　1.2.2.1 用Oligo(dT)为引物，合成cDNA第一链

　　1.2.2.2 用PCR扩增tumstatin基因 PCR体系为50μl体系，Taq酶0.25μl, Taq Buffer 5μl, dNTP 5μl, 上下游引物各1μl，cDNA 10μl。 反应条件为：94℃ 3min，94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1min，35个循环后，72℃延伸10min。

　　1.2.2.3 PCR产物的纯化 对扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒进行回收，电泳鉴定，同时对DNA进行定量。

　　1.2.3 pMD19Ttumstatin克隆载体的构建 连接反应体系为10μl，T载体1μl，PCR产物为3μl，1μl dd H2O，5μl试剂盒自带连接液。16℃连接30min，获得连接产物pMD19Ttumstatin。取10μl连接反应液转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布有IPTG及Xgal的含氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取质粒，Nco I和Xho I双酶切鉴定。

　　1.2.4 pMD19Ttumstatin克隆载体的测序 将酶切鉴定正确的重组质粒送至北京奥科生物技术公司进行测序，将测序结果进行BLAST同源序列比对。

　　1.2.5 pET28a-tumstatin表达载体的构建 测序验证正确的重组质粒经Nco I和Xho I双酶切后，胶回收目的基因片断，并与用相同酶切处理的pET28a质粒在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，连接产物转化感受态BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，提取质粒，经Nco I和Xho I双酶切，鉴定阳性克隆。

　　1.2.6 重组人tumstatin蛋白的表达 挑取阳性克隆接种于含卡那霉素50mg/L的5ml LB液体培养基，37℃振荡培养14h，然后按1∶100比例接种于同样的培养基，37℃振荡扩大培养，当OD值达到0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养6h，分别于1、2、3、4、5和6h各取菌液1ml于离心管中，6000r/min，离心 10min，PBS 洗涤菌体两次，加100μl 电泳上样缓冲液，混匀，煮沸 10min，取 30μl 进行 12% SDSPAGE电泳，以未经 IPTG 诱导的菌体作阴性对照，考马斯亮蓝染色，用Quantity one软件分析tumstatin融合蛋白占菌体总蛋白质的含量比例。

　　1.2.7 Western blot 蛋白电泳后，转印至PVDF膜上, 3%的BSA封闭后，分别与小鼠的抗His一抗、辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG二抗作用, DAB显色法进行Western Blot检测。

　　2 结果

　　2.1 胚肾293细胞RNA的提取

　　总RNA抽提产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统拍照，可见清晰的两条带，分别为28s、18s，且28s和18s两条带亮度之比接近2∶1，表明RNA分子较完整。

　　2.2 RTPCR产物结果

　　RTPCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR扩增产物与人tumstatin理论长度750bp相一致。

　　2.3 pMD19Ttumstatin酶切结果

　　将菌落PCR产物为阳性的克隆提取质粒，分别进行Xho I单酶切、Nco I和Xho I双酶切，电泳分析，泳道3在750bp左右有目的条带，证明目的产物已经插入克隆载体中。

　　2.4 人tumstatin cDNA序列分析

　　测序结果显示,插入片断为750bp，与GenBank中公布的tumstatin基因序列一致。Blast同源序列比对结果显示两者同源性为100%，表明tumstatin 基因成功克隆进T载体。

　　2.5 重组蛋白的鉴定

　　重组蛋白表达的SDSPAGE分析结果显示，经诱导的含重组质粒的E.coli BL21菌体与未诱导的 对照菌蛋白表达相比，在分子量为29KD位置上出现1条新条带。在诱导时间为 1、2、3、4、5和6h时，均有清晰的29KD蛋白带,其中5h时表达量最高，软件分析显示，其蛋白量约占菌体总蛋白量的30%。

　　M：DNA Marker;1:pMD19Ttumstatin质粒对照;2:pMD19Ttumstatin质粒Xho I酶切产物;3:pMD19Ttumstatin质粒Xho I/Nco I双酶切产物   pMD19Ttumstatin质粒的酶切鉴定

　　M：protein molecular weight marker; 1～ 6:30℃下，pET28atumstatin经终浓度为1.0mM IPTG诱导，在 1、2、3、4、5、6h的蛋白表达产物;7:未诱导的阴性对照 不同诱导时间下pET28atumstatin

　　蛋白表达电泳分析

　　2.6 Western blot 结果

　　以小鼠的抗His单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析。结果表明，在分子量为29KD处有一特异清晰的条带,而阴性对照则没有。

　　上述实验表明，本研究成功地构建成了tumstatin原核表达载体，并且高效地表达了重组人tumstatin蛋白。

　　3 讨论

　　随着人们对肿瘤血管生成机制研究的不断深入，抗肿瘤血管生成药物成为一个新的研究热点。tumstatin是继angiostatin和endostatin之后最新发现的源于人血管基膜Col IV的肿瘤新生血管生成的抑制因子，具有明显的抑制肿瘤新生血管生成和诱导其内皮细胞凋亡的活性。由于tumstatin具有组织表达特异性，在胚肾和胚肺中特异表达，本研究中，选取了由胚肾建系的HEK293细胞提取总RNA，设计特异的引物，经过RTPCR，克隆出tumstatin基因。

　　由于tumstatin mRNA的表达量较低，在做PCR的过程中有一定的难度，我们分别对Mg离子浓度、退火温度、模板量和引物浓度等条件做了优化，最终发现，模板量对PCR结果的影响最大，当在50μl体系中加入逆转录产物cDNA 10μl时，tumstatin得到了很好的扩增。

　　在表达载体的构建中，选用了高效表达的pET28a载体，pET28a是pET载体系统成员,该系统是目前在E.coli中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。选取了pET28a上的Nco I和Xho I两个酶切位点插入tumstatin基因，在C端引入6个组氨酸的融合标签序列，有利于tumstatin的鉴定和纯化。IPTG诱导后，SDSPAGE及Western blot结果显示在29KD处有一新的蛋白条带，说明原核表达载体构建成功。

　　整合素αvβ3作为肿瘤上较理想的一个靶位点近来受到人们的关注，它不仅在肿瘤组织细胞表面有高水平的表达，而且在肿瘤新生血管的内皮细胞上也有强烈的表达。相反,在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常组织器官中整合素αvβ3受体表达缺乏或几乎不能被探及。由于tumstatin与其特异的结合能力，同位素标记的tumstatin成为一种潜在的放射受体显像剂，其在临床应用上可能具有重要的价值。在本研究中成功克隆出tumstatin基因，重组表达出tumstatin蛋白，为进一步深入研究其作用机制和肿瘤的放射受体显像奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1] Folkman J.Tumor angiogenesis:therapentic implications[J]. N Engl J Med,1971,285(21):11821186.

　　[2] Maeshima Y, Colorado PC, Kalluri R. Two RGDindependent alpha v beta 3 integrin binding sites on tumstatin regulate distinct antitumor properties [J]. J Biol Chem, 2000, 275(31): 2374523750.

　　[3] Maeshima Y, Sudhakar A, Lively JC, et al. Tumstatin, an endothelial cellspecific inhibitor of protein synthesis [J]. Science, 2002, 295(5552): 140143.

　　[4] Maeshima Y, Yerramalla UL, Dhanabal M, et al. Extracellular matrixderived peptide binds to alpha(v)beta(3) integrin and inhibits angiogenesis [J]. J Biol Chem, 2001, 276(34): 3195931968.

　　[5] Maeshima Y, Manfredi M, Reimer C, et al. Identification of the antiangiogenic site within vascular basement membranederived tumstatin [J]. J Biol Chem, 2001, 276(18): 1524015248.

　　[6] Hamano Y, Zeisberg M, Sugimoto H, et al. Physiological levels of tumstatin,a fragment of collagen IV α3 chain,are generated by MMP9 proteolysis and suppress angiogenesis via αvβ3 integrin [J]. Cancer Cell, 2003, 3(6): 589601.

　　[7] Hamano Y, Kalluri R. Tumstatin, the NC1 domain of alpha3 chain of type IV collagen, is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis and suppresses tumor growth [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 333(2): 292298.

　　[8] McQuade P, KnIght LC. Radiopharmaceuticals for targeting the angiogenesis marker alpha(v)beta(3) [J]. Q J Nucl Med, 2003, 47(3): 209220.