多西紫杉醇和顺铂联合用药对人乳腺癌MCF 7细胞hTERT及C myc基因表达的影响

　　作者：张丽敏,洪专　　作者单位：江苏省肿瘤医院 药剂科,江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的 研究多西紫杉醇和顺铂联合应用对人乳腺癌MCF 7细胞的作用及其机制。方法 MCF 7细胞传代培养后分组加药第1组加入多西紫杉醇(多西紫杉醇组);第2组加入顺铂(顺铂组);第3组加入多西紫杉醇和顺铂(联合用药组);对照组为未加药的MCF 7细胞。加药24、48、72h后收集细胞,MTT法检测各组细胞生长抑制率， PCR ELISA法检测各组细胞端粒酶活性，RT PCR法检测端粒酶逆转录酶hTERT mRNA的表达，Western blot技术检测C myc蛋白的表达。结果 联合用药组人乳腺癌MCF 7细胞的生长和增殖受到明显抑制,多西紫杉醇联合顺铂对端粒酶活性、hTERT mRNA及转录调控基因C myc表达的抑制呈明显的时效和效量相关性。结论 多西紫杉醇和顺铂联合应用对人乳腺癌MCF 7细胞的抑制具有协同加强作用,其机制可能是对MCF 7细胞的端粒酶活性及其端粒酶转录调控基因C myc有较强的抑制作用。

　　【关键词】 人乳腺癌MCF7细胞 多西紫杉醇 顺铂 端粒酶 端粒酶逆转录酶 Cmyc

　　近年来,研究[1]报道大多数乳腺癌中有端粒酶活性和端粒酶逆转录酶hTERT的表达,针对其转录调控机制蛋白C myc的研究也是目前的热点。目前临床上多西紫杉醇(docetaxel)作为化疗药物已广泛用于乳腺癌、肺癌、胃癌和食管癌等的治疗[2 3],并取得较好效果;顺铂也是临床乳腺癌的常用化疗药物。本研究将多西紫杉醇与顺铂联合作用于人乳腺癌MCF 7细胞,探讨两者联合应用在体外抗乳腺癌的作用及其作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 药物

　　多西紫杉醇(英国 罗纳普朗克乐安公司,每支20mg),注射用顺铂(山东齐鲁制药公司,国药准字H37021357)。以上药品临用前用RPMI 1640培养液配成所需浓度。

　　1.2 细胞株及分组

　　人乳腺癌MCF 7细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10%的小牛血清(杭州四季青生物工程公司)的1640培养基(美国GIBCO公司)在37℃、5% CO2培养箱中培养传代。细胞传代后分组加药，第1组加多西紫杉醇(多西紫杉醇组)，第2组加顺铂(顺铂组)，第3组加多西紫杉醇和顺铂(联合用药组)，对照组不加任何药物。

　　1.3 试剂与仪器

　　端粒酶检测试剂盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)为Roche公司产品,RNA提取试剂盒为美国Tripure 公司产品,RT PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司,C myc单克隆抗体购自Santa Cruz公司,酶标羊抗人抗体FITC购自南京华美公司,PCR扩增仪为美国PE公司产品,酶标检测仪为美国Gene公司Biotech产品,冷冻高速离心机为日本HITACH公司产品。

　　1.4 方法

　　1.4.1 各组MCF 7细胞生长抑制率测定(MTT法) 各组取对数生长期细胞用0.02%EDTA消化制成2×104(100μl)-1细胞悬液,接种于40孔板,100μl•(孔)-1,置37℃、5%CO2培养箱孵育过夜。多西紫杉醇组给予0.3、0.6、1.2、2.4、4.8μmol•L-1多西紫杉醇;顺铂组给予2、4、6、12、24μmol•L-1顺铂;联合用药组给予上述浓度的多西紫杉醇和顺铂;对照组为仅加培养基未加药的MCF 7细胞。作用24、48、72h后收集细胞，酶标仪570nm处检测吸光值。绘制各组生长抑制曲线。抑制率计算公式如下：

　　抑制率(%)=(1-加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100%

　　1.4.2 端粒酶活性检测[4] 端粒酶提取:收集细胞用洗涤缓冲液[10 nmol•L-1 Heps KOH(pH7.5),1.5 mmol•L-1 MgCl2,10 mmol•L-1 KCl,1 mmol•L-1 DTT]洗1次,离心后弃去洗液。加入200μl裂解液[10 mmol Tris HCl(pH7.5),1 mmol•L-1 MgCl2,1 mmol•L-1 EGTA,5 mmol•L-1β 巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油]冰浴30min后16000r•min-1、4℃离心,30min 后取上清,测定其蛋白浓度,-80℃保存待用。

　　PCR TRAP 扩增：取待测样品50μg总蛋白,反应体积为 20μl,其中含TS、CX引物和反应混合物。25℃ 孵育30min后在PCR扩增仪上扩增,条件为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 90s;循环30次,再72℃延伸10min。

　　产物杂交检测：取5μl扩增产物,加入20μl变性试剂,25℃孵育10min,再加入225μl杂交缓冲液,振荡混匀后取100μl混合物加入已包被的微孔板的各孔中。37℃下300r•min-1振荡2h,弃去杂交液,用清洗缓冲液洗3次,加入抗 DIG POD工作液100μl,25℃ 孵育30min后再用清洗缓冲液洗5次,加入TMB底物溶液100μl,20min后再加入100μl终止液终止反应,用酶标仪测定标本450nm吸收值(参照波长为690nm)判断结果。

　　1.4.3 hTERT mRNA检测 总RNA的提取：按照Tripure Kit说明书,提取收集的各组细胞中总RNA。RT PCR检测hTERT mRNA的表达：RT PCR所用引物参照文献[4],以GAPDH为内对照。(1)hTERT引物:上游5′CGGAGAGTGTCTCTGGAGCAA3′,下游5′GGA TGAAGCGGAGTCTGG3′，扩增产物145bp;(2)GAPDH引物:上游5′CCATGGAGAAGGCTGGGG3′,下游5′CA AAGTTTGACACGGATGACC3′，扩增产物408bp。使用One step RT PCR System(TARKARA)在PE GeneAmp 9600 Thermocycler上操作。反应总体积50μl(模板RNA 1μg,RT混合物1μl,上、下游引物各0.24μmol•L-1,dNTP 200μml•L-1)。RT PCR程序：50℃ 30min(合成cDNA)及94℃ 2min;共35个循环。94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 90s，最后72℃延伸5min。

　　取8μlPCR产物,在2%的琼脂糖凝胶中电泳分离(以100bp DNA ladder为分子量标准),EB染色后紫外成像。

　　1.4.4 Western Bolt检测C myc蛋白的表达[5] 配置10%SDS PAGE胶。样品1∶1与2×loading buffer混匀,98℃变性5min,上样。80V浓缩胶,120V分离胶,2.5～3h。取下胶,按尺寸剪取大小合适的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜,上下各3层滤纸,中间为胶和膜,胶在负极,膜在阳极,用玻棒仔细赶除气泡,采用半干式转膜,恒流75mA,转膜30min。将转入蛋白的硝酸膜浸入立春红工作液中,染色2～5min后,蒸馏水冲洗,观察转膜效率,用PBST洗去立春红条带。用封口机将各条膜置于自封袋中,封好3边,加入先配的封闭液(需至少搅拌0.5h),搅拌均匀,500μl•条-1,尽可能排除气泡。封闭袋口,平放于摇床上,37℃温育45min～1h。封闭结束后,弃封闭液,用少量Blot wash将残余奶粉漂洗干净,封口机将各条膜封闭于自封袋中,尽可能排除气泡。一抗用Bolt Wash稀释至工作液浓度,500μl•条-1,37℃下恒温摇床反应1h,反应结束后剪开自封袋,废弃抗体,将各条膜置于皿中用Bolt wash清洗3次,10min•次-1。用Bolt wash稀释辣根过氧化酶标记的二抗至工作液浓度,500μl•条-1。按前法封袋。37℃恒温摇床反应1h。反应结束后剪开袋口,弃二抗,用Blot wash清洗3次,10min•次-1。PIERCE发光液A液加B液等体积混匀后灌入制好的自封袋中(勿在强光下配制),反应10min后弃发光液。将膜转移至暗匣中。进暗室曝光显影。胶片用自来水冲洗晾干,于全自动凝胶成像分析系统进行灰度扫描并计算各组相对灰度值。

　　1.5 统计学处理

　　用SAS软件包对检测相关数据进行统计学处理,各组间率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 对各组人乳腺癌MCF 7细胞的生长抑制作用

　　结果表明,多西紫杉醇组和顺铂组的人乳腺癌MCF 7细胞生长均受到一定程度的抑制;而多西紫杉醇和顺铂联合用药后在相对较小的剂量下对人乳腺癌MCF 7细胞就有明显生长抑制作用,并且较单独用药作用加强。联合用药对肿瘤细胞的抑制作用呈明显的时效、量效相关性。

　　2.2 端粒酶活性检测

　　以1～50μg不同浓度的HELA细胞株作为阳性对照,按照ELISA试剂盒说明书进行端粒酶活性测定,其吸收值为0.2～3.5,正常人血清吸收值均低于0.2,因此，将待测标本的吸收值大于0.2定为端粒酶活性表达阳性。结果显示，用药24h后,除未加药组吸收值大于0.2外,其余各加药组吸收值都明显低于0.1,显示单独用药或者联合用药后端粒酶活性呈明显下降。

　　2.3 hTERT mRNA的检测

　　在2%的琼脂糖电泳后可以看到,乳腺癌组织在115bp处出现特异性的hTERT条带;使用的内参照为GAPDH。多西紫杉醇组和顺铂组用药后hTERT mRNA表达都有减少,但是联合用药组hTERT mRNA表达降低更为明显。

　　2.4 C myc蛋白检测

　　通过Western blot法定量观察各组对MCF 7细胞的C myc蛋白表达(内参照为Actin)的影响发现：顺铂组C myc蛋白表达无明显变化;多西紫杉醇组C myc 蛋白表达有所减少;联合用药组蛋白表达明显减少。

　　3 讨 论

　　我国是原发性乳腺癌的高发国家,乳腺癌发病和死亡率均位世界前列。由于乳腺癌发病隐匿,早期诊断率低,病情进展快,绝大部分患者在确诊时已失去手术机会而必须依赖药物治疗。我们探讨了多西紫杉醇联合顺铂对乳腺癌MCF 7细胞的生长抑制作用及对其端粒酶相关基因的表达影响。

　　端粒酶的激活可以导致细胞的永生化,对癌变起重要作用[5]。现已阐明,人体端粒酶由RNA成分(human telomerase RNA component hTR)、hTERT端粒酶相关蛋白1(human telomerase associated protein hTEP1)组成。hTR、hTEP1在许多缺乏端粒酶活性的正常组织中表达,与端粒酶表达无相关性。而hTERT与端粒酶表达密切相关,并且它在端粒酶表达中起决定作用。端粒酶与肿瘤发生、早期诊断、预后密切相关,hTERT作为端粒酶活性决定因素,其表达、调控日益受到人们重视,尤其是与多种癌基因、抑癌基因表达的相互关系[6]。人类C myc原癌基因定位于8q24区,由3个外显子和2个内含子组成。第1外显子不翻译,是转录调控区,只起调节作用,第2、3外显子是翻译区。外显子1、2、3共同编码相对分子质量为65 000的蛋白质,它位于核内,为核转录调节因子,与Max蛋白结合成二聚体,与位于基因启动子的特定的DNA序列E box(5′ CACGTG 3′)结合,激活有关基因转录,大多数启动子有E box结构,包括hTERT。研究证明：C myc mRNA 与hTERT mRNA 表达率、表达量有很好的相关性。

　　我们的研究结果表明,与单独加药比较,多西紫杉醇和顺铂联合应用在相对较小的剂量对人乳腺癌MCF 7细胞就有明显的生长抑制作用,并且较单独用药作用加强，有协同作用。相关机制研究发现，其抗肿瘤作用机制与端粒酶活性的抑制密切相关。我们采用PT PCR方法检测了加药后MCF 7细胞中hTERT mRNA表达,同时Western blot法半定量检测加药后C myc蛋白的表达,结果与端粒酶活性表达的检测结果一致。其调节机制可能是[7]：hTERT启动子包括两个C myc结合部位E box序列,这两个位置非常适合与C myc结合;并且这种结合,被含有E box结构的DNA序列抑制;当其中E box结构发生点突时,则不能抑制上述结合。hTERT启动子含有两个E box,即近端E box和远端E box。当近端E box表达抑制时,hTERT启动子活性下降约90%,近似于表达阴性。然而有些细胞株中,去除远端E box,使hTERT启动子活性明显下降。可见C myc与hTERT启动子E box结合,在转录水平调节hTERT表达。

　　综上所述,我们认为多西紫杉醇和顺铂联合应用可以很好地抑制人乳腺癌MCF 7细胞的生长,而其生长抑制机制可能是由于抑制了肿瘤细胞癌基因C myc的表达,而该基因参与了hTERT mRNA的表达调控,从而降低肿瘤细胞的端粒酶活性。这种针对肿瘤细胞相关癌基因的靶向性研究可能对今后临床用药具有一定的指导作用。

　　【参考文献】

　　[1]Kim N W,Weirich S L,Calvin B,et al.Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J].Method Cell Sci,1995,17:1.

　　[2]Cascinu S,Graziano F,Barni S,et al.A phase Ⅱ study of sequential chemotherapy with docetaxel after the weekly PELF regimen in advanced gastric cancer[J].Br J Cancer,2001,84(4):470 474.

　　[3]Heath E I,Urba S,marshall J,et al.Phase Ⅱ trial of docetaxel chemotherapy in patients with incurable adenocarcinoma of the esophagus[J].Invest New Drug,2002,20(8):95 99.

　　[4]Horikawa I,Cable P L,Mazur S J,et al.Downstream E box mediated regulation of the human telomerase reverse transcripatase (hTERT) gene transcription:evidence for anendogenous mechanism of transcriptional repression[J].Mol Biol Cell,2002,13(8):2585 2597.

　　[5]Oh S,Song Y,Yim J,et al.The Wilms′tumor 1 tumor suppressor gene represses transcriltion of the human telomerase reverse transcripatase gene[J].Biol Chem,1999,274(52)，37473 37478.

　　[6]Greenberg R A,O′Hagan R C,Deng H,et al.Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation[J].Oncogene,1999,18(5):1219 1226.

　　[7]Kyo S,Takahiro M,Takahiro T,et al.Sp 1 cooperate with C myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcripatase gene(hTERT)[J].Nucleic Acids Res,2000,28(3):669 677.