胃癌组织中E-cadherin和MMP-13的表达及意义

　　作者：高娟,张方信,邓芝云,吴汉平　　作者单位：甘肃省兰州大学第二临床医学院消化专业 　2.730050 甘肃省兰州军区兰州总医院消化科

　　【摘要】 目的探讨E-cadherin和MMP-13蛋白在胃癌中的表达及意义。方法采用免疫组织化学法检测61例胃癌及20例正常胃粘膜组织中E-cadherin和MM P-13蛋白的表达情况。结果E-cadherin主要表达于正常胃粘膜，在胃癌组织中的表达降低( P<0.05)。其表达与胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关(P <0.05);MMP-13主要表达于胃癌组织，在正常胃粘膜组织的表达降低(P<0.05)，其表达与胃癌的TNM 分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，与肿瘤分化程度无关(P>0.05);胃癌组织中E-cadherin和MMP-13表达呈负相关(P <0.05)。结论 胃癌组织中E-cadherin和MMP-13负相关表达可能与胃癌浸润转移有关，可做为胃癌恶性程度和转移能力的参考判断指标。

　　【关键词】 胃癌;E-钙粘素;基质金属蛋白酶-13

　　The Expression and significance of E-cadherin and MMP-13 in Gastric Cancer

　　Gao Juan，Zhang Fangxin，Deng Zhiyun,et al

　　Department of Gastroenterology，The Second Clinical Medical College of Lanzhou University ，Gan Su Lanzhou 730050，China

　　【Abstract】Objective To investigate the expression of E-cadherin and MMP-13 in gastric cancer.Methods The expression of E-cadherin and MMP-13 in 61 cases of gastric cancer and 20 cases of normal gastric mucosa were detected by immunohistochemistry.Results E-cadherin was mianly localized on the normal gastric mucosa,The expression of E-cadherin was lower in gastric cancer (P<0.05), and was related to the differentiation,TNM stage and lymph node metastasis(P<0.05). MMP-13 was mianly localized on the gastric cancer, It’s expression was lower in normal gastric mucosa (P<0.05), and was related to the TNM stage and lymph node metastasis(P<0.05), and was not related to the differentiation(P>0.05).E-cadherin expression was negatively correlated with MMP-13 in gastric cancer.Conclusion The decreased expression of E-cadherin and increased expression of MMP-13 are involved in the processes of invasion and metastasis of gastric cancer ,They can be two biomarker for grade malignancy and metastasis.

　　【Key words】 Gastric carcinoma; E-cadherin;MMP-13

　　E-cadherin是一种介导同种细胞互相粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白，是介导上皮细胞间粘附的最主要分子[1]。其表达降低或缺失会使肿瘤细胞粘附性减弱，易于脱离和迁移。MMP-13又称为胶原酶，可以有效降解天然胶原纤维，尤其是对于Ⅱ型胶原，对恶性肿瘤细胞侵袭转移至关重要[2]。目前国内外尚未见E-cadh erin 和MMP-13同时在胃癌中的表达及其相关性的研究，本文采用免疫组化方法检测E-cadherin、MMP-13蛋白在人胃癌中的表达，以探讨E-cadherin、MMP-13蛋白在胃癌中的表达与肿瘤侵袭的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织标本及其来源

　　收集兰州军区兰州总医院2008年4月至2009年4月外科手术切除且临床资料完整的胃癌标本61例，所有患者术后均经病理检查确诊，术前化疗、放疗者不纳入。其中男40例，女21例，年龄28～78岁，中位年龄59岁。根据1999年WHO组织分类标准分为两组：高分化组(乳头状腺癌或管状腺癌)33例、低分化组(低分化腺癌或未分化癌)28例;按照胃癌国际分期分为两组：Ⅰ～Ⅱ期19 例，Ⅲ～Ⅳ期42例;根据有无淋巴结转移分为：无淋巴结转移21例，有淋巴结转移40例。20例对照组为正常胃粘膜组织(均为同期门诊胃镜检查者，胃镜检查于胃窦部取活检4～6块)。

　　1.2 试剂

　　兔抗人E-cadherin多克隆即用型抗体(BA0475)与兔抗人MMP-13(多克隆即用型抗体BA0574)均购于武汉博士德公司。即用型SABC(过氧化物酶)试剂盒以及其他相关产品购于博士德公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 免疫组织化学染色检查

　　采用SABC法，所有标本均用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4um厚连续切片后贴附于经APES处理的切片上，55℃烘烤4小时。组织石蜡切片脱蜡水化;组织高压修复，PBS冲洗3×3分钟;3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，37℃孵育15分钟，PBS冲洗3×3分钟;5%BSA(牛血清白蛋白)液37℃孵育10分钟封闭非特异性抗原;除去血清后分别加入一抗，4℃过夜;37℃复温2小时后PBS冲洗，滴加生物素化二抗37℃孵育20分钟 PBS冲洗;加SABC后37℃孵育20分钟后PBS冲洗;DAB溶液显色3～5分钟，自来水冲洗;苏木精复染，脱水透明，中性树脂封片，镜下观察。每个染色流程均设有对照作为染色质量控制。用PBS液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。

　　1.3.2 阳性结果判定

　　每例切片随机选择10个高倍视野(×40)，每个视野计数100个肿瘤细胞。 E-cadherin和MMP-13阳性染色为黄到棕黄色颗粒。E-cadherin阳性判断标准：E-cadherin主要定位于细胞膜和(或)细胞质，其中癌细胞以胞质着色为主。参照文献[3]将胃癌细胞阳性率≥50%，染色强度与正常胃粘膜上皮相似者定为阳性;胃癌细胞阳性率<50%和/或染色强度较正常胃粘膜上皮弱者为阴性。MMP-13阳性判断标准参照文献[4]：MMP-13定位于胞浆。染色强度分级：无着色为0，淡棕黄色为1，棕黄色及更深颜色为2;阳性细胞数分级：阳性细胞数≤50%为0，51%～75%为1，≥76%为2，两项得分结果相加结果大于2为阳性表达。

　　1.3.3 统计学方法

　　采用SPSS统计软件，应用x2检验及Spearman秩和相关分析对研究结果进行分析比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 E-cadherin和MMP1-13的表达情况

　　E-cadherin在胃癌组织中阳性表达率为31. 1%，在正常胃粘膜组织中阳性表达率为100.0%，胃癌组和正常胃粘膜相比较具有显著性差异(P<0.05);MMP-13在胃癌组织阳性表达率为73.8%，在正常胃粘膜表达阳性率10%。胃癌组和正常胃粘膜相比较具有显著性差异(P <0.05)。E-cadherin和 MMP-13在胃癌组织中的表达。

　　2.2 胃癌组织中E-cadherin、MMP1-13的表达与临床病理因素的关系

　　根据组织分化程度将61例胃癌分为高分化和低分化两组进行比较：E-cadherin表达阳性率随着肿瘤分化程度降低而减少，有显著性差异(P<0.05)。MMP-13表达阳性率与肿瘤的分化程度无关(P>0.05);根据TNM分期比较：E-cadherin在Ⅰ～Ⅱ期的表达阳性率显著高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)，MMP-13在Ⅲ～Ⅳ期的表达阳性率显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P <0.05)，均具有显著性差异;E-cadherin在无淋巴结转移组的表达阳性率显著高于有淋巴结转移者(P <0.05)，MMP-13在无淋巴结转移组的表达阳性率显著低于有淋巴结转移者(P <0.05)，均具有显著性差异。E-cadherin、MMP1-13的表达与胃癌临床病理特征的关系。 E-cadherin、MMP1-13的表达与胃癌临床病理特征的关系 n

　　2.3 胃癌组织中E-cadherin和MMP-13表达的关系

　　E-cadherin、MMP-13在胃癌组织中的表达经Spearman秩和相关分析，E-ca dherin与MMP-13的表达呈负相关(r值-0.323，P<0.05)。

　　3 讨论

　　侵袭和转移是恶性肿瘤特有的性质，是一个复杂的、多步骤、多因素参与的生物学现象。目前的研究发现肿瘤细胞的浸润侵袭能力不仅取决于胞外基质的降解，还与细胞黏附迁徙有关，它们之间协调衔接才能实现有效地侵袭转移。在此过程中，许多黏附分子及蛋白水解酶均不同程度的参与了调控。黏附是肿瘤转移的始动环节，协调上皮细胞之间黏附的主要分子之一为E-cadherin，它是一种以嗜同型方式介导同型细胞-细胞黏附的黏附因子，广泛分布于胚胎组织和成熟的上皮组织中，对于促进细胞的黏附聚集、维持上皮组织形态与结构的完整性、维持细胞极性及细胞的分化调节至关重要。以往研究发现由于E-cadherin基因启动子高度甲基化及编码基因外显子突变[5-6]致其表达减少与多种人类肿瘤侵袭转移相关，而且它表达的降低导致上皮间连接的破坏进而使癌细胞的黏附性减弱，易于脱离原发灶而发生侵袭转移。Oka[7]等对103例胃癌研究发现E-cadherin表达的下调与分化程度及淋巴结转移相关。Gabbert[8]研究显示E-cadherin表达的下调与肿瘤浸润深度、淋巴结转移等无明显相关性。本研究显示胃癌组织中E-cadherin表达明显低于正常胃粘膜( P<0.05);E-cadherin的表达与病理因素分析发现其与分化程度、TNM分期、淋巴结转移呈负相关( P<0.05)，因此作者认为E-cadherin表达的黏附活性状态可能与癌细胞的分化及浸润转移相关，支持E-cadherin为抑癌基因之学说。

　　肿瘤浸润转移过程中的另一个关键因素是瘤细胞对胞外基质成分及基底膜的降解。目前研究认为在肿瘤浸润转移过程中胞外基质的降解是由几个蛋白水解酶系统所致，MMPs家族是其中之一。MMPs是一组Zn2+依赖性蛋白酶，根据作用底物不同分为胶原酶(MMP-1,8,13),明胶酶(MMP-2,9),基质溶解酶(MMP 3,7,10,11),巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)和膜型基质蛋白酶(MMP-14,17)。其主要作用是破坏胞外基质和基底膜从而导致肿瘤细胞侵袭周围组织并发生远处转移;调节肿瘤细胞与基质的黏附;介导肿瘤新生血管形成;激活其他具有潜在活性的蛋白进而影响肿瘤的浸润转移。已有研究发现MMP-13的表达与头颈部肿瘤、软骨肉瘤、膀胱癌、风湿性关节炎等有关。Ayman[2]发现MMP-13的表达有助于胃癌的进展，在活体内是侵袭能力的标志。Del也发现Ⅳ期胃癌中的MMP-13表达显著高于前三期，有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者，同时MMP-13的表达与患者生存期显著相关，提示MMP-13和胃癌的高侵袭性和不良预后有关。本研究对61例胃癌及20例正常胃粘膜组织检测结果显示胃癌组织中的MMP-13表达阳性率高于正常胃粘膜且具有显著性差( P<0.05)，胃癌中MMP-13 的高表达与TNM分期、淋巴结转移相关(P<0.05)，与肿瘤分化程度无关(P>0.05)，提示MMP-13的表达与胃癌的侵袭密切相关，而且E-cadherin和MMP-13两者之间的表达呈负相关(P<0.05)，表明E-cadherin表达的减少及MMP-13表达的增加可能共同促进了这一过程的进展，其原因与E-cadherin能够抑制肿瘤细胞和宿主细胞产生MMP-13,进而抑制肿瘤细胞周围基质和基底膜中的各种成分的降解，防止瘤细胞突破基质和基底膜形成无力屏障有关。 胃癌组织中E-cadherin的低表达与MMP-13的高表达可能与胃癌的浸润转移有关，可做为胃癌恶性程度和转移能力的参考判断指标。

　　【参考文献】

　　[1]Takeichi M.Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator [J]. Science,1991,251:1451

　　[2]Ayman E,Yutaka Y,Etsurou B,et al. Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinase -13) in human gastric cancer[J]. Gastric Cancer,2003,6:30-68

　　[3]Mayer B,Johnson J,Leitl F,et al.E-CD expression in primary and metastatic gastric cancer:down-regulation correlates with cellular dedifferentiation and glandular disintegration [J].Cancer Res,1993,53:1690-1695

　　[4]覃山羽,黄刚丁,黄振宁,等.胃癌MMP-13,CD-44V5表达与肿瘤生物学行为的相关性研究[J].广东医学,2007,28(2):273-275

　　[5]Wheeler JM,Kim HC,Efstathiou JA,et al.Hypermythylation of the promoter region of the E-cafherin gene(CDH1) in sporadic and ulcerative colitis associated colorectal cancer[J].Gut,2001,48(3):367-361

　　[6]Becker KF,Kremmer E,Eulitz M,et al.Functional allelic loss detected at the protein level in archival human tumours using allelespecific E-cadherin monoclonal antibodi es [J].J Pathol,2002,197:567-574

　　[7]Oka H,Shiozaki H,Kobayashi K,et al.Immurnohistochemical evaluation of E- cadherin adhesion molecule expression in human gastric cancer[J].Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol,1992,42(2:)149

　　[8]Gabbert HE,Murller W,Schneiders A,et,al.Prognostic value of E-cadherin expression in 413 gastric carcinomas[J].Int J Cancer,1996,69(3):184-189