三株人乳腺癌细胞中PTEN基因的表达及意义

　　作者：李祥勇,林观平,周克元　　作者单位：广东医学院生物化学与分子生物学教研室，广东湛江 524023

　　【摘要】 目的 探讨PTEN基因在三株人乳腺癌细胞中的表达及意义。方法 采用RTPCR及Western blot法检测三株人乳腺癌细胞株内源性PTEN mRNA及其产物蛋白的表达。结果 PTEN基因的产物蛋白在乳腺癌细胞MCF7中出现高表达，而在两种恶性乳腺癌细胞中却明显出现低表达或缺失表达。结论 PTEN 作为一种新型的抑癌基因, 其突变与缺失可能与恶性乳腺肿瘤的发生发展密切相关。

　　【关键词】 乳腺癌;PTEN基因;肿瘤

　　Significance and expression of PTEN gene in three breast cancer cell lines

　　LI Xiangyong,LIN Guanping，ZHOU Keyuan

　　Department of Biochemistry And Molecular Biology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,China

　　【Abstract】Objective To investigate the significance and expression of PTEN gene in three breast cancer cell lines.Methods RTPCR was used to detect the expression of the endogenous PTEN mRNA,while Western bloting was used to detect the expression of the endogenous PTEN protein in three breast cancer cell lines.Results The PTEN gene product protein appeared a high expression in the benign breast cancer cell,while it was low expression or the loss expression in two kinds of malignant breast cancer cell.Conclusion As a new tumor suppressor gene,PTEN are related to the occurrence and development of the malignant breast cancer.

　　【Key words】breast cancer;PTEN;tumor

　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病呈上升和年龄变小趋势，在许多大中城市乳腺癌已占妇女恶性肿瘤死因的首位。随着细胞分子生物学技术的发展，发现肿瘤的发生发展是多基因共同作用的结果，然而基因突变或调控失常是正常细胞转变为恶性细胞的关键。因此，通过对乳腺癌相关基因及其表达产物的研究, 能够加深了解乳腺癌生物学行为和发病机制，有助于确定乳腺癌预后评价的特征性指标和临床对乳腺癌患者的有效治疗。PTEN是1997年发现的一种新的抑癌基因，定位于人染色体10q23，是由403个氨基酸组成并具有磷酸酶活性的产物蛋白;故PTEN基因可能凭借产物蛋白的磷酸酶活性参与细胞周期的调控，调节细胞的正常生长和发育，促进细胞凋亡，最终达到抑制癌症的作用[1]。本研究应用RTPCR和Western blotting 蛋白印迹法检测PTEN在不同类型乳腺癌细胞株中的表达情况，探讨PTEN基因在乳腺癌细胞发展过程的作用。

　　材料与方法

　　1.材料

　　①乳腺癌细胞系：乳腺癌细胞株ZR751、乳腺癌细胞株MDAMB435S购自中国医学科学院基础医学研究所。乳腺癌细胞株MCF7由本教研室细胞培养室提供。②主要试剂：Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。RTPCR试剂盒购自QIAGEN公司。小鼠抗人PTEN单克隆抗体、山羊抗人Actin多克隆抗体、ECL发光试剂盒为Santa Cruz公司生产。

　　2.方法

　　(1)细胞培养

　　ZR751细胞培养于含15%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640完全培养液中;MDAMB435S细胞培养于含10%新生牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的L15培养基中;MCF7细胞株生长液为含10%新生牛血清、青霉素100 μg/ml、链霉素100 μg/ml的RPMI 1640培养液。所有细胞培养液都加入0.5 U/ml胰岛素，细胞于37℃、5 % CO2饱和湿度孵箱中培养。

　　(2)RTPCR检测乳腺癌细胞中PTEN基因的表达

　　①按Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA。②引物设计与合成：PTEN sense primer：5’aaa gct gga aag gga cga ac 3’;antisense primer：5’cag gta acg gct gag gga ac3’;扩增产物为373 bp。 以GAPDH为内参照，序列为：sense primer：5’ gaa ggt gaa ggt cgg agt c3’;antisense primer：5’gaa gat ggt gat ggg att tc3’;扩增产物为226 bp。③扩增反应条件：50℃逆转录30 min，95℃预变性15 min，循环30次(94℃45 s，55℃1 min，72℃1 min)，最后72℃延伸10 min。④ RTPCR产物的半定量分析：琼脂糖凝胶电泳后观察结果，图像分析软件BandScan 4.3进行光密度积分值分析，计算出PTEN mRNA与内参照GAPDH mRNA的光密度积分值之比作为PTEN mRNA的相对含量值。

　　(3)Westernblot检测乳腺癌细胞中PTEN蛋白的表达 裂解细胞提取总蛋白后，取10 μl用Bradford酶标法测定蛋白含量，与5×上样缓冲液4∶1混合，煮沸5 min后进行SDSPAGE凝胶电泳，将靶蛋白从凝胶转移至PVDF膜。15%脱脂牛奶室温封闭1 h后，加一抗(1∶400)于室温孵育2 h，用TBS洗涤4次，每次15 min;用HRP标记的二抗(1∶2000)孵育1 h，再用TBST(含0.05% Tween 20)缓冲液洗涤4次，每次15 min，使用发光试剂(ECL)显荧光，曝光显影。结 果 1.不同乳腺癌细胞株PTEN mRNA 的表达 RTPCR检测结果表明，在三株乳腺癌细胞ZR751、MDAMB435S和MCF7中，MDAMB435S和MCF7细胞中均有PTEN基因mRNA的表达，而在ZR751细胞中没有此基因mRNA的表达。

　　讨 论

　　作为21世纪基因组学的一个重要研究方向，基因治疗技术在近几年来得到了强劲的发展。在基因治疗领域，对于体内缺乏某个基因或某个基因表达较弱引起的疾病，人们往往可以用外源性基因通过真核表达载体或病毒载体导入体内进行基因治疗。因此，在研究肿瘤的发生发展过程中，探讨抑癌基因的突变与缺失，可为肿瘤基因治疗提供新的研究靶点。

　　PTEN是至今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，它对细胞的生长、浸润、转移和血管发生有重要作用[2]。PTEN蛋白作为唯一一种能使脂类去磷酸化的抑癌基因产物，其作用的底物是细胞内第二信使3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇。在正常的细胞中PTEN蛋白通过PI3K/PTEN/PKB/Akt信号转导途径发挥抑癌作用，PTEN蛋白可拮抗磷脂酰肌醇激酶PI3K的作用，使其作用底物去磷酸化，降低细胞内第二信使3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇的含量，对PI3K/PKB/Akt信号转导途径起负调控作用[3]，从而调节细胞的物质代谢、细胞增殖、分化和凋亡[4]。如果PTEN蛋白表达缺失或减弱, 就不能拮抗蛋白激酶PI3K的作用, 丧失对PI3K/PKB/Akr信号转导途径的负调控, 出现该信号转导途径功能异常[5]。可导致乳腺腺泡上皮细胞失去正常细胞的周期调控, 细胞过度增殖, 易于发生恶性癌变[6]。周隽等[7]研究提示：PTEN与细胞周期调控因子CyclinD1表达的改变是乳腺癌发生的早期事件,共同参与其发生;PTEN的表达水平低下可作为乳腺癌分化和转移的一个潜在的生物学标志,CyclinD1对乳腺癌分化和转移的影响可能部分受到PTEN的调控。说明PTEN异常在乳腺癌发生中起一定作用, 是乳腺癌一种新的相关基因。

　　本实验RTPCR和Western blot检测结果表明了PTEN蛋白与乳腺癌的发生发展及预后有一定相关性。在三株人乳腺癌细胞中PTEN基因的表达各异，在MCF7细胞中不仅有PTEN mRNA的表达，同时存在PTEN蛋白表达产物的高表达;在ZR751细胞中出现了PTEN的缺失或不表达，这可能对于我们在进行抑癌基因PTEN机理研究中的选材具有重要的意义。MDAMB435S细胞中未检测到PTEN蛋白的表达，可能是由于某种原因使PTEN基因处于沉默状态而不能表达其产物蛋白(已展开进一步实验)，故不能发挥抑制癌细胞生长的作用。总之, 我们认为，PTEN在乳腺癌中存在异常表达, 在乳腺癌的发生、发展中起一定的作用,也是乳腺癌的预后因素之一。PTEN作为乳腺癌新的相关基因,值得进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]Li JY，Cao RF，Wang H，et al.Correlation between the PTEN/MMAC1/TEP1 expression and cell proliferation and apoptosis in human renal cell carcinoma[J].Ai Zheng,2003,22(6):607-611.

　　[2]Patel L，Coxon P，et al.Tumor suppressor and anti- inflammatory actions of PPAR gamma agonists are mediated viaupregulation of PTEN[J].Curr Biol,2001,11(10):764-768.

　　[3]Lu Y,Yu Q,Liu JH,et al.Src family protein-tyrosine kinases alter the function of PTEN to regulate phosphatidylinositol 3-kinase/AKT cascades[J].J Biol Chem,2003，278(41):40057-40066.

　　[4]Zhang J,Choi Y,Mavromatis B,et al.Preferential killing of PTEN-null myelomas by PI3K inhibitors through Akt pathway [J].Oncogene,2003，22(40):6289-6295.

　　[5]TamuraM,Gu JG,Matsumoto K,et al.Inhibition of cellmigration, sp reading,and focal adhesions by tumor supp ressor PTEN[J].Science,1998,280 (5369):1614-1619.

　　[6]Nenry TL,Patrice W,Susan T,et al.An update on DNA based BRCA1 /BRCA2 genetic counseling in hereditary breast cancer[J].Cancer Geneti Cytogeneti,1999,109(2):91-98.

　　[7]周隽, 吴强, 吴正升，等.乳腺癌中抑癌基因PTEN与Cy2.clinD1的表达及意义[J].安徽医科大学学报, 2004,39 (2) :106-109.