肝癌蛋白质组学研究进展

　　作者：龙江,王宝恩　　作者单位：首都医科大学附属北京友谊医院 肝病中心,北京 100050

　　【关键词】 肝癌 蛋白质组 人 肿瘤标志物 细胞器

　　原发性肝癌是世界上发病率最高的肿瘤之一，占每年新发恶性肿瘤的4%。由于缺乏有效的诊断标志物，肝癌的诊断多处于疾病的中晚期，而这时也缺乏有效的治疗。研究表明从甲胎蛋白(AFP)升高到亚临床肝癌成立需10个月左右，提示早期诊断完全可能[1]。目前，在肝癌蛋白质组学研究中，人们对于检测早期诊断的肿瘤标志物和药物靶点，以及探索肝癌发生、发展的机理方面取得了一些进展。

　　1 肝癌肿瘤标志物和药物靶点的研究

　　1.1 血清水平蛋白质组学

　　Poon等[2]对20例慢性肝炎和38例肝癌患者的血清用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI TOF MS)鉴定，发现在2384个蛋白点中有250个有显著性差异，联合诊断肝癌的敏感性和特异性达90%，但未找到已报道过的血清标志物。Ward等[3]用SELDI方法检测了84例丙肝肝硬化患者和60例丙肝基础的肝癌患者血清中的蛋白质相对含量,并用人工智能网络对38例患者进行验证。结果发现有17个峰点有显著性差异，其中IgG对于活动性慢性肝病患者来说最具有预测性诊断价值，敏感性为94%，特异性为86%，在肝癌中峰点5.8kDa表达增高，33.2、66.4和102kDa表达下调。Schwegler等[4]用SELDI TOF MS方法分析了54例肝癌、38例肝硬化、36例肝炎和39例健康人血清，鉴定出1.5～20kDa范围内有38个峰有显著性差异，这些蛋白点鉴别肝癌和肝硬化的敏感性和特异性分别为61%和76%，若与AFP、异常凝血酶原(DCP)和高尔基蛋白73异质体(GP73)联合诊断，则敏感性和特异性分别为75%和92%;在相对分子质量5000～12000进一步分析，发现相对分子质量5808和11735可以鉴别HCV(+)的肝癌和丙肝患者。张辉等[5]用SELDI TOF方法检测了24例肝癌和56例正常人血清，发现相对分子质量3500～12000之间有6个蛋白质点有显著性差异，而相对分子质量4801可能为肝癌特异性蛋白。张建中等[6]发现在正常对照组血清中相对分子质量4963.4表达下调，而肝癌患者相对分子质量5337.5和5905.1较正常对照组明显上调。Paradis等[7]利用SELDI TOF对38例正常人和44例肝癌患者血清进行比较，在30个差异蛋白质点中筛选出相对分子质量8900可作为肝癌诊断的标志性蛋白质片段。

　　Steel等[8]对健康人、HBV携带者、慢性乙型肝炎和HBV(+)肝癌患者的血清进行2 D分析,发现与健康组相比,肝癌组有2个点相对大量地减弱，经质量指纹图谱鉴定，分别是补体C3的羧基端和载脂蛋白A1的异形体。

　　Comunale等[9]用去N糖基化的方法对健康人、HBV携带者、慢性乙型肝炎和肝癌患者的血清进行检测，发现血浆铜蓝蛋白的一个片段和前血清淀粉体P元件在去N糖基化后可能是诊断标志物。

　　冯钜涛等[10]将肝癌、肝炎和健康人3组各20例血清用基质辅助激光解析飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight massspectrometry，MALDI TOF MS)进行鉴定，发现转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白在肝炎和肝癌组低表达，α 1抗胰蛋白酶、凝聚素、铜蓝蛋白、触珠蛋白在肝炎和肝癌组均高表达，α 1抗胰蛋白酶在肝癌中高表达，而热休克蛋白27只在肝癌组表达。

　　目前，血清水平的蛋白质组学研究是最多见的，但由于血清成分复杂，包括高丰度蛋白质，如白蛋白、免疫球蛋白等，以及低丰度蛋白，如细胞因子、趋化因子和多种组织细胞的代谢产物，结合实验方法的不同，使得有关蛋白质表达的结论不尽相同，而且不同实验结果不能相互验证。因此，可以说血清蛋白质组学的研究仍是一个挑战。

　　1.2 组织水平蛋白质组学

　　Jina等[11]对11例肝癌患者的癌组织和相对正常组织作配对分析，发现肿瘤组织中9种蛋白高表达，包括二硫化物异构酶A3，这种酶已被证明在乳腺癌组织和低氧损害的神经胶质细胞中有高表达;28种蛋白低表达，包括热休克蛋白27、乙酰辅酶A脱氢酶、甘油3磷酸脱氢酶、乙烯还原酶、组织蛋白酶、醛脱氢酶、衰老标志蛋白30等。Kim等[12]将21例肝癌患者的样品(肿瘤组织和肿瘤旁组织)分为3组：7对HBsAg(+)，7对抗HCV(+)，7对HBsAg和抗HCV(―-)。经MALDI TOF MS分析，有60个蛋白点有显著性差异。其中，14个蛋白在3组中有同样的变化，46个蛋白有病毒特异性趋势。Lim等[13]对比了正常肝组织、HBsAg(+)的肝硬化组织和肝癌组织，认为肌氨酸脱氢酶、肝脏羧酸酯酶、脯氨酰肽异构酶A和核纤层蛋白B1可作为肿瘤标志物。Zeindle等[14]将人肝癌样品经2 D分离，在相对分子质量30000～40000进行肽质量指纹图谱分析，找到6个变异体蛋白，它们都属于呋喃酮还原酶超家族，分别为醛糖还原酶、人醛糖还原酶样蛋白(hARLP)1～5。

　　1.3 细胞水平蛋白质组学

　　Seow等[15]对整和有HBV基因的肝癌细胞系HCC M进行分析，鉴定出191个基因编码的272种蛋白，包括管家蛋白乙醇脱氢酶、α 烯醇酶、天冬酰氨酸合成酶、葡萄糖6磷酸 1 脱氢酶等，以及肿瘤发生相关蛋白，如14 3 3蛋白、膜联蛋白、抑制素、磷酸酪氨酰磷酸激酶激活因子、RNA结合蛋白调节亚基、复制蛋白A32000亚基、N 唾液酸磷酸合成酶等。Liang等[16]建立了肝癌细胞系HCC M双向电泳蛋白质组数据库，这为寻找诊断标志物和药物靶点提供了依据。

　　Yu等[17]对比肝癌细胞系BEL 7404和人正常肝细胞系L 2的2 D图谱，找到99个显著差异点，其中次黄嘌呤 5′ 单磷酸脱氢酶2、热休克蛋白27、钙网硬蛋白、钙调蛋白和有肿瘤抑制作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂在肝癌细胞中表达上调，而谷胱甘肽 S转移酶P在肝癌细胞中的量是正常细胞的18倍。

　　2 肝癌发生机制的研究

　　2.1 细胞水平蛋白质组学

　　Ding等[18]对比分析了具有不同转移潜能的肝癌细胞系MHCC 97H和MHCC 97L的蛋白质组，有56个蛋白点有显著性差异，鉴定出的14个蛋白都与已报道的肿瘤转移有关，按其功能可分为细胞骨架及相关蛋白、胞外基质降解相关蛋白、钙结合蛋白、碳水化合物代谢酶类和恶性生长相关酶类，这为研究肝癌转移的机制提供了依据。

　　2.2 亚细胞水平蛋白质组学

　　由于双相电泳分辨率的局限，在全细胞蛋白质谱中，大量的低丰度蛋白质未能得到显现，而这些低丰度蛋白质往往是具有重要功能的调控因子。近年，经过分离纯化的细胞器结构蛋白质复杂度降低，低丰度蛋白质得到富集，提高了检出的数量。同时细胞器蛋白质组提供了亚细胞层面的信息，对于理解细胞功能和疾病发生机制有重要的意义。

　　从Angus分析HeLa细胞的细胞核开始，至今鉴定出692种蛋白质，其中超过90%的蛋白质在分离的细胞核中多次得到验证，但仍有约110种蛋白质的功能未知[19]。

　　李兴等[20]以人肝癌细胞QGY 7703与正常肝细胞LO2为研究模型，分离细胞的线粒体和细胞核，用MALDI TOF MS方法鉴定出22种差异蛋白质，其中17种在肝癌细胞中表达上调，5种表达下调。参与能量代谢的ATP合成酶、细胞色素C氧化酶、丙酮酸羧化酶以及参与细胞迁移、识别的Ezrin和凋亡调节因子CASP8和FADD在肝癌细胞表达上调;核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)hnRNPA2/B1和hnRNPA1在肝癌细胞表达显著增高，可能是肿瘤早期诊断标志物和治疗的靶点。筛选出的蛋白质涉及细胞的能量代谢、蛋白质合成、细胞骨架与核骨架的改变、mRNA的加工成熟及凋亡调控等方面，表明癌变细胞的结构和代谢都有很大的变化。

　　Christine等[21]分析了鼠肝高尔基体的蛋白质谱，鉴定出41种蛋白质，其中2种是高尔基体局限性蛋白质，并证实高尔基体具有甲基转移酶的活性，为进一步了解细胞功能和疾病状态时蛋白质的表达和修饰提供了有效的工具。

　　蛋白质组学从最初基于2 D电泳发展到基于色谱的分离技术，以及多种差异分析技术，如同位素标记技术(ICAT)、SELDI、凝胶内差别电泳(DIGE)等的引入，丰富了人们对肝癌的认识。但由于样品的种类、制备方法、操作规程等多种因素的影响，不同实验有关肝癌蛋白质表达的研究结论不尽相同，这表明蛋白质组学研究还有待于在提高通量化和低丰度蛋白的分辨率、完善蛋白质数据库、增加小量样品的灵敏度以及规范操作规程上进一步完善。

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