洛铂诱导顺铂耐药卵巢癌SKOV3/DDP细胞的凋亡

　　作者：刘萍萍　　作者单位： 昆明,云南省肿瘤医院干疗科

　　【摘要】目的 探讨洛铂体外诱导人卵巢癌顺铂耐药SKOV3/DDP细胞凋亡及其机制。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定不同浓度和时间洛铂对SKOV3/DDP细胞的生长抑制作用，并与其亲本细胞SKOV3(敏感株)相比较;进一步通过光镜及透射电镜观察SKOV3/DDP细胞的形态学改变;并采用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 洛铂作用SKOV3/DDP细胞的增殖呈时间剂量依赖模式受到抑制，与SKOV3细胞相比，差异无统计学意义(P>0.05);一定浓度的SKOV3/DDP作用一定时间，可诱导SKOV3/DDP细胞发生凋亡;光镜和透射电镜下可见典型的凋亡细胞形态学改变;流式细胞技术分析发现洛铂作用首先引起细胞周期分布的改变，随用药时间的延长，凋亡率逐渐升高。结论 洛铂通过诱导凋亡而抑制体外培养的SKOV3/DDP细胞生长，其机制可能与细胞G0/G1期阻滞有关。

　　【关键词】 洛铂，乐铂，卵巢肿瘤，细胞凋亡，SKOV3 SKOV3/DDP

　　洛铂(Lobaplatin)是第三代铂类衍生物，该化合物为1，2二氨甲基环丁烷乳酸合铂，抗癌活性强、毒性较轻、溶解度好，在水中稳定[1]。国内外研究证明，洛铂对许多临床前的肿瘤模型都有效，但在洛铂对顺铂耐药的卵巢癌方面的研究较少，国内尚未见报道。因此，本研究以卵巢癌顺铂耐药株SKOV3/DDP为模型，初步探讨其对卵巢癌耐药细胞生长抑制、凋亡诱导及周期阻滞的作用，为明确洛铂能否用于顺铂耐药卵巢癌患者的治疗奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株

　　人浆液性乳头状囊腺癌顺铂耐药系SKOV3/DDP、亲本细胞株SKOV3均由中国医学科学院肿瘤研究所提供，用含10%标准胎牛血清(天津灏洋生物技术公司)的RPMI1640(美国GIBCO公司)培养基于37℃、5%CO2条件下培养。实验用细胞均处于对数生长期。

　　1.2 实验用药

　　3(4，5二甲基噻唑2rl)2,5乙苯基四唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均为Sigma公司产品;洛铂(Lobaplatin)为海南长安国际制药有限公司产品(批号：H20050308)，将药物用三蒸水溶解成4mg/ml，过滤除菌，-20℃保存备用。临用前用RPMI1640完全培养液稀释至工作浓度。

　　1.3 方法

　　1.3.1 MTT比色法 检测洛铂对SKOV3、SKOV3/DDP细胞株的增殖抑制作用。取对数生长期的肿瘤细胞以5×104/ml密度接种于96孔板中，每孔200μl,过夜贴壁，第2天分别向培养细胞中加入培养液200μl并分组，阴性对照组加肿瘤细胞和培养液，空白组只加培养液，实验组加含不同浓度洛铂的培养液，浓度梯度为2、4、8、16、32、64μg/ml,以上每组同一浓度药物均设4个平行孔，37℃、5%CO2分别培养24h、48h、72h。结束培养前4h，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，培养箱继续培养4h。弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡5～10min后，用美国BioRad公司550型酶标读数仪测定光吸收值(OD值)，测定波长570nm，分别计算不同浓度洛铂对SKOV3、SKOV3/DDP生长抑制率。每个时段实验重复3次。

　　抑制率(%)=[1-(实验组OD值均值-空白组OD均值)/(对照组OD值均值-空白组OD值均值)]×100%

　　1.3.2 形态学观察 (1)光镜观察：浓度为5×104/ml的SKOV3/DDP细胞悬液接种于预置盖玻片的24孔培养板中，每孔1ml，过夜贴壁，第2d分别更换洛铂浓度为0、2、4、8、16、32、64μg/ml的培养液，培养72h，常规制备细胞爬片，HE染色，光学显微镜下观察;(2)透射电镜观察：收集洛铂浓度为0、16μg/ml培养液培养的细胞，离心成团，2.5%戊二醛固定，常规电镜制样，日本JEM1101型透射电镜观察。

　　1.3.3 洛铂对SKOV3/DDP细胞周期时相分布的影响 分别收集1×106个0、40μg/ml的洛铂作用24、48、72h的细胞， PBS洗涤2次，转入Eppendof管，重悬细胞于PBS中，加入RNase及PI避光4℃染色30min，应用BECKMANCOULTER流式细胞仪上机检测并用COULT WINCYCLE软件做DNA分析。

　　1.4 统计学处理 实验数据以±s表示，利用SPSS12.0统计软件，组间分析采用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 洛铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞增殖的影响

　　不同梯度的洛铂分别对SKOV3和SKOV3/DDP细胞作用24～72h，其生长抑制率见表1、2。洛铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞体外生长均有明显的抑制作用，其抑制率呈现明显的时间—剂量依赖关系。洛铂对SKOV3/DDP细胞的抑制率与对SKOV3细胞的抑制率相比，差异无统计学意义(F=0.095～2.305，P>0.05)。

　　2.2 洛铂对SKOV3/DDP细胞的形态学影响

　　光镜下对照组：细胞长梭形或多边性，细胞形态饱满，胞质丰富，偏蓝，胞核居于细胞中央，细胞呈丛簇状排列，生长旺盛;实验组：当洛铂浓度大于8μg/ml时，随药物浓度的增加，贴壁的正常细胞数逐渐减少，并可见较多的凋亡细胞，这些细胞多散在，或呈小堆排列，细胞皱缩呈圆形或卵圆形，胞质皱缩，嗜酸性增加，核染色质浓集呈紫蓝色致密的球状，见图1。电镜下对照组：细胞核大，核仁明显，常染色质丰富;胞质内游离核糖体丰富，线粒体及粗面内质网少见;实验组：细胞皱缩，胞质致密，可见凋亡小体，部分细胞坏死，见图2。

　　2.3 洛铂对SKOV3/DDP细胞周期和凋亡的影响

　　洛铂作用SKOV3/DDP细胞24、48、72h后，FCM检测其细胞周期的改变，结果见表3。洛铂表1 洛铂药物浓度及作用时间对SKOV3细胞OD值及抑制率的影响表2 洛铂药物浓度及作用时间对SKOV3/DDP细胞OD值及抑制率的影响表3 各组细胞周期百分率及细胞凋亡率能明显改变SKOV3/DDP的细胞周期，与对照组比较S期、G2/M期细胞明显减少，细胞生长被阻滞在G0/G1期，并随着药物作用时间的延长，凋亡率逐渐增加，尤其是药物作用72h时G0/G1峰之前可见到明显的亚二倍体峰，见图3。

　　3 讨论

　　卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，我国卵巢癌的发病率位于宫颈癌和宫体癌之后，居第三位，70%的卵巢癌患者在就诊时已为晚期，致使手术不能根治。化疗是卵巢癌最重要的辅助治疗手段，肿瘤减灭术后给予联合化疗是改善卵巢癌预后的关键。顺铂是目前治疗上皮癌最有效的首选药，有效率达29%～35%，顺铂的疗效呈明显剂量依赖性，但严重的肾毒性限制了其剂量的增加，且易产生耐药。由于一线化疗后顺铂耐药的存在造成卵巢癌患者5年生存率较低，仅为30%左右。洛铂作为第三代铂类化合物，具有抗瘤谱广、毒副反应小、抗顺铂耐药的特点，其抑癌作用引起众多学者的关注[24]。实验表明洛铂能抑制人白血病、结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肾癌等多种癌细胞的生长，特别是对某些顺铂耐药的细胞株亦显示出较好的抑瘤活性，临床研究也证实对小细胞肺癌，慢性粒细胞性白血病和乳腺癌细胞有杀伤作用[5,6]。但能否抑制顺铂耐药的卵巢上皮癌细胞的生长及其作用机制迄今尚未见报道。

　　本研究应用洛铂对体外培养的人卵巢上皮癌耐药株SKOV3/DDP的抗癌作用及机制进行了实验探讨。结果表明，在洛铂的干预下，SKOV3/DDP细胞的生长受到了抑制，这种抑制呈时间剂量依赖形式，随洛铂作用时间的延长、药物剂量的增大，细胞生长抑制程度加重。这与国内作用于其他胞株的研究结果相似[7]。SKOV3/DDP细胞系具有顺铂耐药性，相对于SKOV3细胞，其耐药指数约为4倍。它是由大连医科大学建株，为SKOV3细胞用DDP(4mg/ml)作用1小时，反复间歇给药[8]。洛铂对SKOV3/DDP细胞生长的抑制作用与对SKOV3细胞生长的抑制作用相比差异无统计学意义，这为将洛铂用于对DDP耐药的卵巢癌患者的化疗提供了有力的证据。

　　本实验对洛铂作用下的SKOV3/DDP细胞的凋亡相关指标进行了检测，其中形态学变化是判断凋亡有无发生的基础[9]。研究结果发现，SKOV3/DDP细胞经一定浓度的洛铂作用一定时间，光镜下可见细胞固缩变圆、细胞核出现空泡、核碎裂，电镜下见典型的凋亡细胞。提示洛铂通过诱导SKOV3/DDP细胞凋亡影响其生长。

　　细胞周期中检测点的失调与肿瘤发展密切相关，抗癌药往往通过使细胞阻滞于某一时相而发生凋亡[10]。洛铂作用后的细胞周期动力学分析表明，一定浓度的洛铂作用24、48、72h后，随作用时间的延长，细胞凋亡指数升高，G0/G1期细胞增多、S期、G2/M期细胞明显减少。提示洛铂通过抑制DNA合成作用，使细胞阻滞在G0/G1期。G0/G1期阻滞可能是洛铂诱导凋亡的机制之一。

　　尽管本实验证实了洛铂具有诱导SKOV3/DDP细胞凋亡的作用，但仅通过形态学观察及流式细胞仪定量的方式尚不能完全反映凋亡细胞内部发生的本质变化，特别是洛铂通过何种途径诱导顺铂耐药细胞发生凋亡。化疗药物杀伤肿瘤细胞主要是通过诱导细胞凋亡机制，其中包括DNA损伤、激活凋亡启动程序，最终导致肿瘤细胞死亡。凋亡受阻是肿瘤细胞的另一生物学特性，多种药物耐药均与凋亡作用抑制有关[11]。bcl2基因是第一个被发现的凋亡抑制基因，SKOV3/DDP细胞内表达高水平的bcl2，较高的bcl2蛋白表达可增强肿瘤细胞对多种凋亡促进因子的抗性，抑制细胞凋亡[12]，洛铂是否通过下调SKOV3/DDP细胞内bcl2蛋白的表达而促进细胞凋亡，其机制尚待进一步探讨。

　　【参考文献】

　　[1]Aetema Laborries.Lobaplatin(D19466)[J].DrugsR&D,2003,4(6):369372.

　　[2] Harstrick A,Bokemever C,Scharnofkse M,et al.Preclinical activity of a new platinum analogue,lobaplatin,in cisplatinsensitive and resistant human testicular,ovarian,and gastric carcinoma cell lines [J].Cancer Chemother Pharmacol,1993,33(1):4347.

　　[3]Meijer C,Mulder NH,TimmerBosscha H,et al. Relationship of cellular glutathione to the cytotoxicity and resistance of seven platinum compounds [J].Cancer Res,1992,52(24):68856889.

　　[4] Harstrick A,Vanhoefer U,Heidemann A,et al. Drug interactions of 5fluorouracil with either cisplatin or lobaplatin a new, clinically active platinum analog in established human cancer cell lines [J]. Anticancer Drugs, 1997,8(4):391395.

　　[5]冯光丽，廖美琳，赵家美，等.乐铂单药治疗42例原发性支气管肺癌[J].中国癌症杂志，2000，10(4)：306308.

　　[6]姜文奇，林桐榆，徐瑞华,等.乐铂单药治疗乳腺癌的Ⅱ期临床研究[J].实用癌症杂志，1998,13(14)：294295.

　　[7]殷玉志，陈珊珊. 乐铂对HL60细胞程序化死亡诱导作用研究[J].北京医科大学学报，1995，27(3)：173175.

　　[8]孙正怡，许秀英，郎景和，等.羟基喜树碱和topotecan对人卵巢癌细胞株体外作用的研究[J].中华妇产科杂志，1999，34(9)：547550.

　　[9]彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床[M].第1版.北京：人民卫生出版社，2000.153.

　　[10]Montague JW，Cidlowski JA.Cellular catabolism in apoptosis:DNA degradation and endonuclease activation[J].Experientia,1996，52(1011)：957962.

　　[11]Beale PJ,Rogers P, Boxall F，et al. Bcl2 family protein expression and platinum drug resistance in ovarian carcinoma[J].Br J Cancer,2000,82(2)：436440.

　　[12]栗宝华，胡东晓.体外培养人卵巢癌细胞株SKOV3、SKOV3/DDP并探讨卵巢癌顺铂耐药机制[J].中国妇幼保健，2005，20(10)：11951197.