SELDI蛋白芯片技术在肿瘤早期诊断中研究进展

　　作者：余家密 作者单位：福建医科大学，福建 福州 350004

　　【摘要】 SELDI蛋白芯片技术全称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是近年用来研究蛋白质组学的一项新的技术平台，具有高通量、高效率、高灵敏度等特点，可以快速地分析各种生物样品中蛋白质组的组成，在基础医学研究、临床疾病诊断以及药物研发方面显示出广阔的应用前景及临床意义。文章就其技术组成、原理、特点和在肿瘤早期诊断中的应用及发展前景作一综述。

　　【关键词】 肿瘤

　　人类基因组序列草图完成后，生命科学进入了“后基因组时代”,研究的重点转向了对复杂的蛋白质功能的研究。蛋白质是基因表达的最终产物，器官组织的生理状态变化会引起血清蛋白质组的改变，因此对蛋白质和蛋白质组学进行研究可以直接获取疾病的特征性标志。由于人血清是一个蛋白质相当丰富并不断变化的系统，单一的血清肿瘤标记物难以真正反溯到相关的细胞组织，而发现一组与特定组织癌变相关的血清蛋白质(多参数标记物)则是更有效的途径，这也就是所谓的“癌症指纹(cancer signature)”[1]，而高通量的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)质谱技术的出现加速了开展发现“癌症指纹”的研究。目前利用SELDI技术发现肿瘤的特殊生物学标记，对于肿瘤的早期诊断具有独特的优势和重要的意义，在多种肿瘤的研究中显示出良好的应用前景。

　　1 SELDI-TOF-MS

　　1.1 组成及工作原理

　　表面增强激光解析电离光谱技术是由2002年诺贝尔化学奖得主田中耕一(Tanaka)发明， 由美国赛弗吉(Ciphergen)公司研制特殊芯片并生产SELDI-TOF-MS质谱，该系统由3部分组成：①蛋白质芯片;②激光吸收离子化质谱设备(Reader);③人工智能数据分析处理软件[2]。蛋白芯片阵列有8~24个2mm大小的含有特异性层析表面的芯池。根据芯片表面化学成分的不同，分为化学表面芯片和生物表面芯片。前者包含疏水(hydrophobic surface，H4)，亲水(normal phase，NP)，弱阳离子交换(weak cation exchange，WCX)，强阴离子交换(strong anion exchange，SAX)，金属离子鳌合(immobilized metal affinity capture，IMAC)，特异结合(preactivated surface，PS)等芯片，主要用于蛋白质表达分析和比较，如疾病相关蛋白筛选;后者分为受体—配体、DNA—蛋白质、酶等芯片，可选择性地从待测生物样品中捕获靶蛋白质。

　　SELDI技术的原理是利用激光脉冲辐射使芯片表面的分析物解析成带电离子，质荷比不同的离子在电场中飞行时间不同，据此绘制出一张强度不等、分子量不同的谱图。SELDI软件能快速处理、分析大量的质谱图信息，将正常人与某种疾病或者疾病不同阶段的图谱进行比较，就能发现和捕获该疾病及不同阶段时的特异性相关蛋白质[3，4]。

　　1.2 特 点

　　以往蛋白质研究多采用层析、双向电泳、光谱、质谱等技术。它们在蛋白质检测中起到了不同作用，但存在缺点和不足，如所需样本量大、条件高、蛋白纯化步骤繁琐、耗时长，有的仅适合分析高丰度的蛋白质且分子量在20kD以上的蛋白质，但难以检测血清中占很大比例的低丰度蛋白质，因此不适宜大规模人群筛查和临床检验。而SELDI-TOP-MS技术将特异的蛋白质芯片系统和质谱仪结合起来,具备以下优点：①样本不需要预先纯化，可直接将血清、尿液、组织和细胞裂解物等样本加到芯片上检测;②获得的图谱较单一，重复性好，可检测分子量在200kD～500kD的蛋白质，尤其适用于低丰度蛋白质或多肽的检测[5];③样品用量少，一般0.5μl～15μl或2 000个甚至20个细胞即可;④敏感性高，可达到1fmol;⑤同一系统中集蛋白质分离、纯化、鉴定、检测和数据分析为一体，省时、省力，特别适用于基础医学研究、临床诊断及大规模人群筛选;⑥推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，或基于蛋白质特点发现新的基因。

　　2 SELDI技术在肿瘤早期诊断中应用

　　利用SELDI技术分析比较正常人血清、体液、组织蛋白质与异常者间的表达差异，筛选出与肿瘤相关的蛋白标记并进行确认，用于疾病的早期诊断以提高生存率。目前这一技术已运用于多种肿瘤的早期诊断研究中，并已显示出美好的应用前景。

　　2.1 肝 癌

　　肝癌是非洲、中国和东南亚国家最常见的恶性肿瘤之一，其生存率低，很大一部分是由于诊断时病程已到了进展期，失去了很好的治疗机会[6]。目前肝癌的早期诊断主要依靠血清AFP的检测，但近年来大量临床研究表明，AFP阳性率波动在60%~70%[7]，约有1/3的患者血清AFP阴性，同时AFP升高者有时难以和慢性良性肝病区别，这给临床诊断带来极大的困然。Poon等[8~10]利用SELDI技术对原发性肝癌早期诊断、分型及HBV相关慢性肝病(肝纤维化、肝硬化)进行研究，通过人工神经网络模型分析，结果显示对肝癌的诊断当特异性为90%时，灵敏度为92%，对肝癌的分型和肝纤维化与肝硬化的正确区分有很好的辅助作用，而且研究指出利用SELDI蛋白芯片技术发现的标志物与血清AFP浓度无关。另外Schwegler等[11]、 Paradis等[12]也在这方面进行了研究，取得了相似的结果。Ward等[13]应用SELDI蛋白芯片技术分析HCV相关性HCC、肝硬化血清182例，区分两者的灵敏度和特异性分别为94%、96%，并鉴定出HCC血清中2个蛋白峰为κ和γ免疫球蛋白轻链。以上研究说明SELDI技术应用于肝癌早期诊断的可行性，由此发现的特异的蛋白标志物，其灵敏度和特异性远比传统的单一的血清AFP高，并且对肝癌的诊断不受AFP浓度的影响，提示对AFP阴性肝癌患者的早期诊断可能有很好的辅助作用。

　　利用蛋白质芯片技术分析组织蛋白图谱，寻找与肝癌发生发展相关的蛋白质，有助于进一步阐述肝癌发病机制。Melle等[14]检测了10例HCC患者的组织样本,样本取自癌组织、癌旁组织和非癌部位。用SAX和WCX芯片分别检测到14~26和25~29差异表达的峰，可准确区分癌与非癌组织(P<0.05)，还提示利用SELDI技术可以在蛋白水平上研究肝癌发生发展相关的机制。

　　2.2 肺 癌

　　肺癌是目前全球发生率最高的恶性肿瘤之一，在我国的发病率和死亡率迅速上升。目前影像学、痰细胞学、纤维支气管镜等检查对肺癌的诊断有一定的作用，但对早期肺癌的发现困难，尤其是癌前病变和原位癌[15]。研究表明肺癌被确诊时80%以上已属中晚期，5 年生存率仅14%[16]。Zhukov等[17]联合LCM(激光捕获显微切割)和SELDI技术，研究了正常肺组织、肺不典型腺瘤样增生(AAH)组织和肺癌组织的上皮细胞，结果发现在肿瘤细胞组有3种蛋白质表达明显增加，其中相对分子质量为17.25×103的蛋白质在正常细胞组中未发现，在AAH组中呈低表达。研究认为通过该技术发现的蛋白质标记物可以早期发现肺癌和癌前病变，并可以对肺癌的高危人群进行监测及对肺癌化疗后疗效的评估。杨拴盈等[18]随机抽取53例非小细胞性肺癌(NSCLC)，21例小细胞肺癌和20名正常人94份标本，将筛选出来的5个蛋白峰作为一个标志物组合模式，建立分类树模型，用69份未知血清标本(49例NSCLC，20名正常人)作为盲筛组验证该模型。结果显示，在94例建模组中应用该模式检测NSCLC的敏感性和特异性分别为95.9%和90.0%;盲筛组分别为83.7%及80.0%。提示蛋白质芯片SELDI技术能较准确地区分NSCLC患者与健康对照者，该技术为NSCLC的筛查提供了新的有效工具。

　　2.3 卵巢癌

　　CA125是目前临床普遍用来诊断卵巢癌的生物学标记物。80%晚期病人CA125升高，50%~60%Ⅰ期病人CA125可升高，但阳性预测值低于10%[19]。

　　美国食品和药物管理局(FDA)和美国国立卫生研究院(NIH)的临床蛋白质组研究小组的成员Petricoin等[20]使用SELDI技术研究了116例患者的血清样本，其中50例为卵巢癌患者，66例非恶性肿瘤患者作为对照组，发现5个特异峰同时变化，对于卵巢癌的诊断具有重要意义。用该模型对样本进行盲法分析预测，50例卵巢癌样本全部被准确检出，66例非恶性肿瘤人群对照组中有63例被正确确定，该方法的敏感性为100%，特异性为95%，阳性预测值为94%(该方法已于2004年获FDA批准应用于卵巢癌的临床检测)。Moshkovskii等[21]采用SELDI-MS、2-DE及HPLC方法对27份卵巢癌标本中的蛋白质组进行分析，15例(55.6%)标本出现11.7kDa及11.5kDa双峰，而对照组34例中仅2例(5.8%)出现双峰现象，同时发现11.7kDa的本质为血清淀粉酶A1，11.5kDa为其N-末端缺少精氨酸的变构体，两者皆可作为早期卵巢癌的肿瘤标志物。国内也在这方面进行了诸多研究，王琪等[22]采用IMAC3和WCX2两种芯片对99例卵巢恶性肿瘤、21例卵巢良性肿瘤、87例正常对照血清进行分析，通过建立诊断模型，得出对卵巢恶性肿瘤的正确诊断敏感度为100%，特异度为98%，并且提出质荷比为7 769的蛋白质为卵巢恶性肿瘤的潜在标志物。

　　SELDI蛋白芯片技术可有效筛选血清中特异性蛋白标志物，为建立卵巢癌的诊断模型提供可靠的技术平台。

　　2.4 乳腺癌

　　CA153用于乳腺癌的检测，其灵敏度23%，特异性69%，只能用于监测治疗效果和复发情况。LI等[23]对169例血清进行检测，其中乳腺癌103例，正常人41例，其它乳腺疾病25例，结果发现3个潜在的新肿瘤标志物，将其组成蛋白组用来诊断分析，其灵敏度93%，特异性91%，提示该方法可用于筛选乳腺癌生物标记物。

　　细针穿刺细胞学检查(FNA)是一种简便、应用较广的肿瘤辅助诊断方法，但对浸润性癌与非浸润性癌的诊断不确定，也难以得到反映乳腺癌生物学特性的一些分子生物学检查所需的组织标本，因此在Fowler等[24]的研究中，对24例由FNA获取的吸出物采用甲醛进行初步的固定，然后在一定条件下进行变性等处理，再采用SELDI质谱仪进行检测，结果发现利用所得的图谱有助于良恶性乳腺疾病的鉴别诊断，同时得到一种较简单的获取组织蛋白的方法，但需更多的试验进行进一步的论证。

　　此外, SELDI技术还被应用于前列腺癌[25]，结肠癌[26]、头颈部肿瘤[27]、胰腺癌[28]、胃癌[29]等的研究中,均显示该技术有助于肿瘤的早期辅助诊断。

　　3 前景及展望

　　蛋白芯片SELDI技术除应用于肿瘤早期诊断中外，在其他疾病的研究(如艾滋病、老年性痴呆)、疗效检测、发病机制探讨、新药研发和基础理论研究等方面亦具有广泛应用。但是由于是一项新出现的技术，也存在一些不足之处，如小分子量蛋白质的检测仍然没有像大分子量蛋白质检测那么容易，质谱检测出的蛋白质不能直接鉴定，必须通过后续的检测方法判断蛋白质的种类，另外，目前全世界SELDI-TOP-MS实验室在质控血清建立及仪器标准化状态、自动化应用等方面存在着不统一的标准[30]，因此，对于SELDI发现的生物标记物在用于临床诊断及其干预治疗之前，必须进行严格的多中心和三期临床质控验证。随着该技术在各种疾病中的纵深研究和技术理论不断的完善和发展，通过大规模研究蛋白质性质、蛋白质之间相互作用及肿瘤标志物的论证和研究，推动蛋白质组学、基因组学和肿瘤学的研究进程，发现和确定越来越多的组织特异的新肿瘤标记物，从而实现疾病尤其是肿瘤的早期诊断，满足癌症病人的需要。

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