乳腺癌转移相关蛋白mRNA定量表达与临床相关性研究

　　作者：曹旭晨，肖春花，冯玉梅，李晓青，郝希山 作者单位：300060 天津医科大学附属肿瘤医院乳腺一科

　　【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2(MMP2)和纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN) mRNA表达量与乳腺癌转移的关系及临床意义。方法 采用荧光定量RTPCR方法检测30例乳腺原发癌和配对淋巴结转移癌以及116例乳腺癌的MMP2和FN mRNA表达量，分析MMP2和FN mRNA表达量与乳腺癌转移及临床病理因素相关性。结果 30例淋巴结转移癌的MMP2和FN mRNA表达量低于原发癌，组间比较差异有显著性(P<0.05)。肿瘤直径大、临床分期晚及淋巴结转移数目多的MMP2和FN mRNA表达量低于肿瘤直径小、临床分期早及淋巴结转移数目少的乳腺癌。MMP2和FN mRNA表达量与病理类型、组织学分级、雌、孕激素受体及Her2表达无关。结论 随着乳腺癌转移潜能的增加，MMP2和FN在转录水平的表达下调。

　　【关键词】 乳腺癌，转移，基质金属蛋白酶，纤维粘连蛋白

　　Expression and Clinical Relationship of Correlated Protein mRNA with Breast Cancer Matastasis

　　CAO Xuchen，XIAO Chunhua, FENG Yumei, LI Xiaoqing, HAO Xishan

　　Department of Biochemistry & Molecular Biology，Tianjin Medical University Cancer Hospital, Tianjin 300060, ChinaAbstract：Objective To discuss the clinical significance of matrix metalloproteinase2 (MMP2) and Fibronectin(FN) mRNA with breast cancer metastasis. Methods Detect MMP2 and Fibronectin(FN) mRNA expression of 30 breast cancer、metastatic lymphnode and 116 clinical breast cancer samples by flurencequantitative RTPCR and analysis the relativity of MMP2 and Fibronectin(FN) mRNA expression with clinical、pathology factors. Results MMP2 and Fibronectin(FN) mRNA expression in 30 metastatic lymphnode is lower than in primary breast cancer(P<0.05). The mRNA expression of MMP2 and Fibronectin(FN) in big tumor,late stage, more lymph nodes is lower than in others. The MMP2 mRNA and Fibronectin(FN)expression is irrelated with tissue grade、pothologic type、ER、PR and Her2. Conclusion MMP2 mRNA and Fibronectin(FN)expression is downregulated with tumor progressing, and related with the metastasis of breast cancer.

　　Key words：Breast cancer;Matrix metalloproteinase2 (MMP2);Fibronectin(FN);Metastasis

　　乳腺癌转移的重要步骤是基底膜和细胞外基质的降解，基质金属蛋白酶2(MMP2)是此过程中重要的酶类。FN是细胞外基质中的糖蛋白。MMP2降解基底膜和细胞外基质为血管内皮的迁移和新生血管的延伸创造条件，FN参与细胞粘附和基质降解。我们采用荧光定量RTPCR方法检测了30例配对转移癌和116例乳腺原发癌MMP2和FN mRNA定量表达，探讨与乳腺癌转移及临床病理因素的相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料

　　收集本院2002年1月～2003年12月116例乳腺癌根治术标本，术中即刻取原发癌和淋巴结转移癌，其中淋巴结转移癌须经病理学评价，选取癌细胞达75%以上的淋巴结。患者年龄32～79岁，平均49岁。原发癌116例、配对淋巴结转移癌30例;I期17例、II期65例、III期34例;淋巴结阳性68例、淋巴结阴性48例;单纯癌66例、浸润性导管癌28例、髓样癌12例、腺癌10例;组织学分级I级37例、II级46例、III级33例。免疫组化检测ER、PR，阳性细胞数30%以上为阳性;免疫组化方法检测Her2受体，10%以上为阳性。检测外周血CA153，25U以上为阳性。标本冻存于80℃冰箱中。收集过程注意避免RNA酶污染。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RNA的提取

　　采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取组织标本RNA，微量核酸定量分析仪(Biochrom Ltd Cambridge)测定浓度并电泳检测RNA质量。

　　1.2.2 MMP2和FN引物与Tagman探针

　　采用Oligo6.0软件设计引物和探针，管家基因引用文献[1]序列。MMP2：Forward 5’CGCTCA GATCCGTGGTGAGAT3’Reverse 5’CGGGAGCTCAGGCCAGAATG3’Probe 5’(FAM)TTCTTCTTCAAGGACCGTTCATTTGGC3’(TAMRA);FNForward 5’CCGCCGAATGTAGGACAAGA3’Reverse 5’TGCCAACAGGATGACATGAAA3’Probe 5’(FAM)CAACCATCTCATGGGCCCCATTCC3’(TAMRA);GAPDH Forward 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3’，Reverse 5’GAAGATGGTGATGGGATTTC3’，Probe 5’(FAM)CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC3’(TAMRA)。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.3 荧光定量RTPCR实验

　　采用ThermoscriptTM plus/ platinum一步法试剂盒(Invitrogen公司)，反应条件参照说明书。结果计算：CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所进行的循环数。原发癌与配对淋巴结转移癌比较以MMP2和FN mRNA荧光定量结果的CT值减去GAPDH的CT值得到△CT值，以转移癌△CT平均值作为矫正数。计算2△△CT值，以2△△CT值为RNA表达量。

　　1.3 统计学分析

　　采用Spss10.0软件包，乳腺原发癌与淋巴结转移癌组间比较采用配对t检验，临床病理因素两组间比较采用独立样本t检验，两组以上比较采用方差分析。MMP2和FN mRNA表达量采用线性回归和双变量线性相关分析。

　　2 结果

　　2.1 乳腺原发癌和淋巴结转移癌的MMP2 mRNA表达量

　　30例淋巴结转移癌MMP2和FN mRNA表达量低于原发癌，组间比较差异有显著性(P≤0.05)，见表1。

　　2.2 MMP2 和FN mRNA表达量与临床病理因素的关系表1 30例乳腺癌和转移淋巴结的MMP2和FN mRNA 表达MMP2 和FNmRNA表达量在肿瘤小、临床早期、淋巴结转移早期表达量上调，随着肿瘤的进展表达量下调。MMP2 和FNmRNA表达量与病理类型、组织学分级无关，见表2。

　　3 讨论

　　乳腺癌浸润和转移是复杂的多步骤序贯过程，是众多因子相互协调以及共同作用的结果。Liotta等[2]提出了肿瘤浸润的三步学说，即粘附、降解、移动，首次明确指出肿瘤浸润与细胞外基质降解之间的关系。转移是瘤细胞与宿主相互作用的复杂过程，肿瘤细胞到达转移器官须穿透基底膜，MMP2可以降解基底膜的IV型胶原[3]，是浸润和转移的重要指标。此外癌细胞与基质相互作用、调节粘附、增殖和分化。FN [4]是参与细胞与基质以及细胞间相互粘附的主要基质糖蛋白，介导细胞与胞外基质的相互作用，在细胞的粘附、迁移、生长及分化过程中起重要作用[5]。MMP2作用主要为降解胞外基质，增强癌细胞转移，促进新生血管的形成[6]。乳腺癌血管形成促使肿瘤生长，及侵袭和转移。肿瘤血管形成主要由肿瘤释放血管生成因子、血管周围的基质降解和重塑，内皮细胞的增殖和迁移等，MMP2通过降解基底膜及细胞外基质为血管内皮的迁移和新生血管的延伸创造了必要条件。FN是整合素(Integrin)受体家族中众多成员的一个配体，FN与整合素结合刺激了其介导的细胞粘附[7]，FN还结合于肝素、胶原、纤维蛋白等分子上，它含有两个与肝素硫酸糖蛋白相互作用的结合片段[8]，肝素的强结合端位于C端，弱结合端位于N端，FN与肝素分子结合决定了胞外基质对细胞粘附的作用。此外FN通过结合位点与纤维蛋白结合，对细胞粘附和迁移起重要作用。

　　我们采用荧光定量RTPCR方法，检测30例淋巴结转移癌和116例乳腺原发癌MMP2 和FNmRNA表达量，结果30例配对淋巴结转移癌的MMP2和FN mRNA表达量均低于30例原发癌。文献报道[9,10]采用免疫组化方法研究发现MMP2和FN蛋白表达在转移癌高于原发癌。Xishan Hao等[11]通过9对针吸乳腺原发癌和转移癌标本对表2 MMP2 和FN mRNA表达量与临床病理因素的关系 MMP2和FN mRNA表达量研究，结果MMP2和FN mRNA表达量在转移癌低于原发癌，推测mRNA与蛋白表达量不一致是由于在mRNA表达水平存在负反馈调节。众多研究表明[12]淋巴结转移是乳腺癌预后差的重要临床指标，淋巴结转移对乳腺癌预后评价有显著意义。淋巴结阳性的乳腺癌其癌细胞的浸润能力显著高于淋巴结阴性的乳腺癌，预后差。本研究中淋巴结阳性的乳腺原发癌MMP2 mRNA的表达量略高于淋巴结阴性的乳腺原发癌，组间比较差异无显著性;而FN mRNA的表达量在乳腺原发癌中高于淋巴结阴性的乳腺原发癌，组间比较差异显著，说明随着FN mRNA表达量的增高瘤细胞浸润和转移能力增强。进一步分析了MMP2 和FN　mRNA表达量与肿瘤大小、临床分期、组织学分级、淋巴结转移数目的关系，结果显示肿瘤大、分期晚、淋巴结转移数多组的MMP2 mRNA表达量低于肿瘤小、分期早、淋巴结转移少组，提示MMP2 mRNA表达量在肿瘤发生的早期表达上调，随着肿瘤的增大、临床分期的增高、淋巴结转移数的增加而下调。而FN mRNA表达量在大肿瘤和临床晚期组低于小肿瘤和临床早期组，但是淋巴结转移阳性数大于4个组高于4个以下组。MMP2和FN mRNA表达量在各病理类型、组织学分级的组间比较差异不显著。

　　目前有大量研究已证实，乳腺癌雌、孕激素受体状态与肿瘤的分化程度和淋巴结转移程度有关[13]。Pichon等[14]报道，在预后因素中ER的作用较大，认为ER阳性者复发率比ER阴性者低。雌孕激素受体是判定乳腺癌预后的生物学指标之一。ER、PR阳性者较阴性者的治愈率高，复发率低。实验结果表明，MMP2　mRNA表达量与ER、PR状态无关。而ER、PR阳性组的FN　mRNA表达量高于ER、PR阴性组。Her2是一种原癌基因， Her2高表达与乳腺癌患者预后不良有关，HER2阳性的乳腺癌对激素及化疗不敏感[15]。116例乳腺癌HER2阳性与HER2阴性分组对比，结果HER2阳性组的MMP2 和FN mRNA表达量均高于HER2阴性组，但两组之间差异无显著性。CA153是研究较早的癌基因 ，对乳腺癌没有特异性，未见有关CA153与乳腺癌方面的报道。作为常规术前检查，我们分析了CA153阳性组与CA153阴性组的MMP2 和FN的mRNA表达量，结果CA153阳性组高于阴性组。

　　综上所述，乳腺癌患者治疗失败，其主要原因是由于癌细胞的侵袭、转移未得到控制，而乳腺癌癌细胞的转移与微环境密切相关，MMP2和FN是微环境中重要的作用因子之一。我们的实验结果证实了MMP2 和FN　mRNA表达水平与乳腺癌的转移相关，可以为乳腺癌转移治疗及预后评估提供新的靶点。

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