恶性肿瘤患者CD4+CD25+/CD4+CD25high调节性T细胞的研究

　　作者：姚军霞 刘莉 黄士昂 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院干细胞中心，武汉 430022

　　【摘要】 目的：探讨恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+/CD4+CD25high调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)水平的特点及其临床意义。方法：采用流式细胞术检测Treg水平，并进行分层分析。结果：62例恶性肿瘤患者外周血中CD4+CD25+Treg、CD4+CD25highTreg占T细胞的百分比分别为19.61%±8.17%和4.20%±1.90%，高于正常对照组(分别为P<0.05和P<0.001)，它们与NK细胞呈负相关(r分别为-0.236 1和-0.306)。随疾病进展，CD4+CD25+Treg水平升高，肿瘤进展期(IV期)与前3期比较有极显著差异(P<0.001)。CD4+CD25highTreg占CD4+T细胞的百分比率逐渐升高，中期(Ⅲ期)患者与早期患者、正常对照组比较有极显著差异(P<0.001);晚期患者与中期患者比较有极显著差异(P<0.001)。结论：恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+/CD4+CD25highTreg水平的升高，与恶性肿瘤免疫功能低下及肿瘤的发生发展密切相关。

　　【关键词】 恶性肿瘤;调节T细胞;流式细胞仪

　　调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)在体内外具有调节功能。1995年Sakaguchi等[1]首次分离出了CD4+CD25+调节性T细胞亚群，并证实它具有抑制其他T细胞活化的功能。CD4+CD25+Treg具有低反应性和免疫抑制性两大特点[2]。低反应性是指其在体外很难扩增、繁殖，免疫抑制性是指其能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖。近来的研究发现此Treg与肿瘤免疫逃逸有密切关系[3]。BaecherAllan等[4]报道健康人外周血中发现高表达CD25的CD4+调节T细胞(CD4+CD25high)，其特性与小鼠体内血液中的CD4+CD25+调节T细胞相同。

　　本文采用流式细胞术检测了恶性肿瘤患者不同时期外周血CD4+CD25+/CD4+CD25high调节T细胞和NK细胞水平，探讨其与肿瘤发生、发展的关系及其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　全组62例恶性肿瘤患者均为2002年10月～2005年1月在华中科技大学协和肿瘤医院门诊/住院患者，男性40例，女性22 例，患者年龄24～78岁，平均(54.6±11.2)岁。所有病例均经病理证实，肺癌20例, 鼻咽癌(NPC)18例，非何杰金氏淋巴瘤10例，胃肠道肿瘤9例，乳腺癌3例，其他2例。临床分期按UICC1997年标准。其中(Ⅰ期+Ⅱ期)15例，Ⅲ期21例，Ⅳ期26例。其中，复发性乳腺癌1例，复发性大肠癌2例。近1个月未做过抗肿瘤治疗，近3个月未使用过免疫增强剂。对照组为我院体检健康者15例，男9例，女6例，年龄26～68岁，平均(48.2±12.3)岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 主要试剂

　　PE标记的鼠抗人CD4、CD16、CD56抗体，FITC标记的鼠抗人CD25、CD3抗体，Cychrome标记的CD69和CD45 RA抗体，同型对照分别为PE标记的鼠抗人IgG1免疫球蛋白，FITC标记的鼠抗人IgG1免疫球蛋白，均为美国BD公司产品。

　　1.2.2 方法

　　所有观察对象于清晨空腹抽取静脉血2 ml，EDTA抗凝。应用荧光直接标记法流式细胞术检测外周血CD4+CD25+/CD4+CD25high调节T细胞亚群水平及NK细胞水平：取不同荧光标记的单克隆抗体各20 μl，分别加入100 μl肝素抗凝的外周血，室温下孵育15分钟，加入红细胞裂解液，PBS洗涤2次，用流式细胞仪(BD公司，FACS Calibur)检测，Cellquest软件分析数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异对照值。

　　1.3 统计学处理

　　实验所获结果用x±s表示，采用t检验。关联分析采用线性相关分析。

　　2 结果

　　2.1 恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+Treg水平

　　正常对照组CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+的14.40%±4.69%，62例恶性肿瘤CD4+CD25+Treg水平占总CD4+T细胞的19.61%±8.17%，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分层分析，随疾病进展，外周血CD4+CD25+Treg水平升高，在肿瘤进展期(Ⅳ期)尤其明显，与前3期比较统计学有极显著差异(P<0.01)，见图1。

　　2.2 恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25highTreg水平

　　正常对照组CD4+CD25highTreg细胞占总CD4+的2.04%±0.52%，62例恶性肿瘤CD4+CD25highTreg水平占总CD4+T细胞的4.20%±1.90%，差异有统计学意义(P<0.001)。进一步分层分析，随疾病进展，患者外周血CD4+CD25highTreg占CD4+T细胞的百分比率逐渐升高：21例中期(Ⅲ期)患者此比率为3.52%±1.51%，与早期患者(Ⅰ+Ⅱ期)、正常对照组比较统计学有极显著差异(P<0.001);26例晚期(Ⅳ期)患者此比率为4.85%±1.67%，与Ⅲ期患者比较统计学有极显著差异(P<0.001)，见图2。

　　2.3 肿瘤患者外周血CD4+CD25+/CD4+CD25high调节T细胞细胞表面标记特点

　　肿瘤患者细胞表面标记检测显示与正常对照组CD4+CD25+Treg细胞相同，这群细胞标记特点为CD45RA低表达，不表达CD69，见图3、图4。

　　2.4 CD4+CD25+/CD4+CD25high与NK细胞的关系

　　62例恶性肿瘤患者NK细胞占淋巴细胞的百分比为14.38%±7.92%，与CD4+CD25+/CD4+CD25high调节性T细胞之间存在负相关(r分别为-0.2361和-0.306)，即随着CD4+CD25+/CD4+CD25high调节性T细胞水平的上升，NK细胞水平下降。

　　3 讨论

　　根据Treg表面标记，产生的细胞因子和作用机制的不同，Treg可分为CD4+CD25+Treg细胞、Tr1和Th3等多种亚型[5]。Tr1和Th3可产生抑制性细胞因子，可抑制自身免疫性疾病的发生[6]。目前研究得较为清楚的亚型为CD4+CD25+Treg，其不属于Th1或者Th2亚群CD4+T细胞。在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有5%～10%的细胞持续表达CD25分子(IL2受体α链)，CD4+CD25+Treg同时表达CTLA4等表面分子。

　　在小鼠体内，CD4+CD25+调节性T细胞能够防止自身免疫性疾病和炎性疾病的发生[7]。在癌症患者中，许多由自体同源T细胞识别的肿瘤相关抗原已被证实是正常的自体成分，而不是突变基因的异常产物，表明肿瘤免疫在一定程度上是一种自身免疫[8]。所以有学者认为，CD4+CD25+调节性T细胞对肿瘤免疫也将发挥重要作用。研究表明给无胸腺裸鼠注入去除CD4+CD25+Treg细胞可以引发抗肿瘤免疫反应。Jones等[9]发现用antiCD25McAb去除CD4+CD25+Treg可以抑制黑色素瘤生长。在正常动物中, CD4+CD25+Treg可以抑制识别自身肿瘤细胞的肿瘤效应细胞的发育和活化。在无应答性小鼠体内，直接去除CD4+CD25+Treg可引起有效的抗同源肿瘤免疫反应。另外同时给予抗CTLA4单克隆抗体和抗CD25单克隆抗体, CD4+CD25+Treg数量将大大减少,抗肿瘤免疫反应也得以明显增强，提示CD4+CD25+调节性T细胞能够抑制肿瘤免疫反应。

　　CD4+CD25+调节性T细胞的肿瘤免疫抑制作用还体现在其对NK细胞的抑制特性上。NK细胞是主要的肿瘤免疫作用细胞，肿瘤患者的NK细胞往往功能低下。本研究结果表明，肿瘤患者体内的NK细胞低于正常，且与CD4+CD25+/CD4+CD25high调节性T细胞的水平呈负相关。Wolf等的实验有助于我们对这一现象的理解，将K562细胞与NK细胞共培养4小时，发现NK细胞具有对K562细胞的溶解作用，但若在共培养前将NK细胞与CD4+CD25+调节性T细胞以1∶1共培养2小时，则可以显著降低NK细胞介导的靶细胞的溶解。这一结果有力地证明，来自肿瘤患者的调节性T细胞能够有效抑制NK细胞介导的抗肿瘤反应。

　　Wolf等[10]证实，人体内CD4+CD25+Treg细胞的发生、表型、功能等方面均与小鼠体内的CD4+CD25+T细胞很相似。给肿瘤患者短时期使用抗CD25抗体可以引发或提高肿瘤免疫。Udaya等[11]发现肺癌、乳腺癌和胰腺癌患者瘤内调节性T细胞增多;Curie等[12]发现肿瘤组织中含有很高的调节性T细胞,而且其数量与病人的肿瘤进展程度和预后呈负相关。Edward等[13]研究非小细胞肺癌病人外周血中的CD4+CD25+调节性T细胞，发现其在外周血中比例明显增高。

　　本研究结果显示，62例恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+/CD4+CD25highTreg细胞成分增加，而且，外周血调节T细胞比例的增加与肿瘤的临床分期相关，Ⅲ、Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+/CD4+CD25highTreg细胞水平高于Ⅰ+Ⅱ期患者，而且进展期(Ⅳ期)肿瘤患者其外周血的

　　CD4+CD25+/CD4+CD25highTreg细胞水平明显升高，提示恶性肿瘤患者免疫功能失调与肿瘤患者外周血调节T细胞比例增加有关。肿瘤患者调节性T细胞介导的免疫耐受和肿瘤的生长密切相关，可能直接参与肿瘤进展的发生过程。与外周血Treg细胞水平低者相比，外周血CD4+CD25+/CD4+CD25highTreg细胞水平高者其预后较差。以上结果显示在肿瘤发展过程中CD4+CD25+Treg细胞可能起着重要的作用，外周血CD4+CD25+/CD4+CD25highTreg细胞水平可以提示恶性肿瘤的预后。

　　在体内去除CD4+CD25+Treg可以消除其对肿瘤的免疫无应答性，引起肿瘤特异性和非特异性效应细胞的自然发育。这种新的激活抗肿瘤免疫的途径可能有助于临床设计有效的抗肿瘤治疗方案。CD4+CD25+Treg是一种重要的具有免疫调节作用的T淋巴细胞,目前尚有许多问题有待进一步研究,对该细胞的深入研究将有助于对机体免疫调节机制的了解以及对肿瘤的病理、生理机制的认识, 有助于恶性肿瘤的早期诊断，并为其免疫治疗提供新的途径。

　　【参考文献】

　　1 Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M et al.Immunologic selftolerance maintained by actibated T cell expressing IL2 receptor alphachains(CD25) .Break down of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases [J].J Immunol,1995;155(3):11511164.

　　2 Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi et al.Thymus and autoimmunity: production of CD4+CD25+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic selftolerance [J]. J Immunol, 1999;162(9):53175326.

　　3 Emma J, Michaela D V, Denise G et al. CD25regulatory T cells and tumor immunity [J].Immunol Lett,2003;85(2):141143.

　　4 BaecherAllan C, Brown J A, Gordon J et al. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood [J]. J Immunology, 2001; 167(3): 12451253.

　　5 Roncarolo M G, Levings M K.The role of different subsets of T regulatory cells in controlling autoimmuity [J]. Curr Opinion Immunol,2000;12(6):676683.

　　6 Seo N,Hayakawa S,Takigawa M et al.Interleukin10 expressed at early tumour sites induces subsequent generation of CD4+Tregulatory cells and systemic collapse of antitumour immunity [J].Immunology,2001;103(4):449457.

　　7 Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S. Induction of tumor immunity by removing CD4+CD25+T cells: a common basis between tumor immunity and autoimmunity [J]. J Immunol, 1999; 163(10): 52115218.

　　8 Houghton A N, Gold J S, Blachere N E. Immunity against cancer: lessons learned from melanoma [J].Curr Opin Immunol,2001;13(2):134140.

　　9 Jones E, Dahm Vicker M, Golgher D et al. CD25+ regulatory T cells and tumor immunity [J]. Immunol Lett,2003;85(2):141143.

　　10 Wolf A M, Wolf D, Steurer M et al. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients [J]. Clin Cancer Res, 2003;9(2):606612.

　　11 Udaya K L,Todd T M, Hong G J et al.Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma [J]. J Immunol,2002;169(5):27562761.

　　12 Curie T J, Coukos G, Zou L et al.Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced suvival [J].Nat Med,2004;10(9):942949.

　　13 Edward Y W,Heidi Y,Chu C S et al.Cutting edge:regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cell proliferation [J].J Immunol,2002;168(9):42724276.