VEGF及MMP7与大肠癌的关系

　　作者：申兴斌，王瑞婷 ，梅爱敏，金小平，张文斌 作者单位：1.067000 河北省承德医学院附属医院病理科;2. 承德医学院药理教研室

　　【摘要】 目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP7)表达与大肠癌进展及预后的关系。方法 采用免疫组SP法检测81例大肠癌(CC)中VEGF及MMP7的表达。结果 VEGF的表达与大肠癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、Dukes分期呈正相关。而MMP7表达与大肠癌的淋巴结转移、远处转移、Dukes分期呈正相关，黏液癌中表达明显高于高分化腺癌，年龄<60岁的大肠癌患者MMP7表达显著强于≥60岁者。VEGF与MMP7表达呈正相关。结论 MMP7 、VEGF促进了大肠癌组织的生长和转移，具有协同作用，可作为大肠癌的预后评估因子，联合检测以上指标对评估大肠癌的预后可能更准确。降低MMP7、VEGF的表达和活性可能成为抗肿瘤转移治疗的一个新途径。

　　【关键词】 大肠癌;血管内皮生长因子;基质金属蛋白酶7;免疫组化

　　大肠癌(colorectal carcinoma, CC)是一种常见的消化道恶性肿瘤, 近20年来, 其发病率逐年增加。细胞外基质降解和新生血管形成是肿瘤生长、浸润和转移的必要条件。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)能降解细胞外基质及血管基底膜，可能促进肿瘤细胞的浸润和血管的形成，而MMP7只在癌细胞和异型增生的上皮细胞中表达[1]。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)通过作用于其受体促进新生血管形成等机制可能参与肿瘤的发生、发展[2]。目前国内外联合检测CC中MMP7、VEGF表达的报道较为少见，本实验以81例大肠癌标本作为研究对象，用免疫组化SP法检测VEGF，MMP7的表达，探讨其在大肠癌生长、转移中的作用, 进一步阐述其与大肠癌进展及预后的关系。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　收集承德医学院附属医院肿瘤外科2001年9月～2002年10月手术切除的CC标本81例。其中男性36例，女性45例，年龄30～85岁，平均57.2岁。Dukes分期根据我国补充方法进行：A期18例，B期25例，C期26例，D期12例。发生部位：结肠癌41例，直肠癌40例;大体类型：溃疡型52例，肿块型24例，缩窄型5例;组织分化程度：高分化腺癌22例，中分化腺癌38例，低分化腺癌11例，粘液腺癌10例;浸润未超过固有肌层(propria muscularis,PM)组22例，超过固有肌层组59例;无淋巴结转移组43例，有淋巴结转移组38例;无远处转移组69例，有远处转移组12例。兔抗人VEGF多克隆抗体，SP9000试剂盒购自北京中山公司,鼠抗人MMP7单克隆抗体，SP(Kit9720)试剂盒均购自福州迈新公司.

　　1.2 SP免疫组化染色

　　切片脱蜡入水，3ml/L甲醇过氧化氢作用5 min，非免疫血清阻断30 min，依次加入稀释后(1∶50)I抗(孵育过夜)，Ⅱ抗(孵育30min)，Ⅲ抗(孵育30 min)，期间用PBS缓冲液冲洗，最后于DAB液显色后，复染、脱水、透明、封片，染色时均设立阴性对照(以PBS液代替I抗)和阳性对照已知胃癌阳性切片。

　　1.3 结果判定标准

　　以肿瘤细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，阳性表达的判断按照Volm[3]的判断标准：(1)选染色均匀的肿瘤区，在400倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数，共计数5个视野，取平均值，以着色细胞占视野细胞总数的多少分0～3级;(2)按细胞着色强弱分级亦分为3级。按(1)、(2)值之和判断结果：阴性(-)：0分;弱阳性(+)：1～2分;中度阳性(++)：3～4分;强阳性(+++)：5～6分。

　　1.4 统计方法

　　数据库的建立和数据分析采用SPSS11.0软件。VEGF，MMP7采用秩和检验, 相关性分析采用Spearman等级相关。

　　2 结果

　　2.1 VEGF与大肠癌临床病理特征的关系

　　VEGF的着色部位位于癌细胞的胞浆和胞膜，见图1，间质的部分血管内皮细胞亦有少量弱阳性着色，着色强阳性部位多位于肿瘤浸润的边缘，见图2。81例大肠癌标本中80例阳性表达，浸润未超过肌层的22例大肠癌中13例(59.1%)为弱阳性表达, 4例(18.2%)强阳性，而59例浸润超过肌层组弱阳性为8例(13.6%)，强阳性31例(52.5%)，两组间差异有统计学意义(u=3.982，P<0.01);淋巴结转移组38例中均为阳性表达，其中25例(65.8%)呈强阳性表达，而无淋巴结转移组43例中仅10例(23.3%)强阳性表达，两组比较差别有统计学意义(u=4.277，P<0.01);远处转移组12例中VEGF表达1例中度阳性，11例(91.7%)强阳性，69例无远处转移组中24例(34.8%)强阳性表达， 21例(30.4%)弱阳性，两组比较差异有统计学意义(u=3.501，P<0.01);大肠癌Dukes A～D期，VEGF表达有增高趋势，四组强阳性表达率分别为11.1%，32%，53.8%，91.7%，四组间差别存在统计学意义(H=28.199，P<0.01), B、C、D期与A期相比差别均有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，B、C期与D期差别亦有有统计学意义(P<0.01, P<0.05)，而B与C期差别不明显，见表1。

　　2.2 大肠癌中MMP7的表达与大肠癌临床病理特征的关系

　　MMP7阳性表达多表现为癌细胞的胞浆中出现棕黄色颗粒，见图3，有5例CC细胞浆和胞核均有着色，见图4。在81例大肠癌组织中79例阳性表达，随着分化程度的降低，MMP7表达增高，四组间MMP7表达有显著差别(H=8.394，P<0.05),两两比较虽然高、中、低分化腺癌间差别不明显，但三组中随分化程度降低强阳性率逐渐升高，见图5。10例粘液腺癌中7例(70%)强阳性，与高分化腺癌有显著差别(P<0.01);淋巴结转移组38例均为阳性表达18例(47.4%)强阳性，无转移组2例阴性，13例(30.7%)强阳性，两组比较差别有统计学意义(u=2.182，P<0.05);远处转移组12例均为阳性表达，其中10例(83.3%)为强阳性，无远处转移组20例(29%)强阳性表达，MMP7在两组间的表达差别有统计学意义(u=3.362，P<0.01)。大肠癌Dukes A～D期MMP7的表达呈增高趋势，四组存在显著差别(H=11.175，P<0.01), A、B、C期明显低于D期(P<0.01，P<0.01，P<0.05);本实验还发现MMP7的表达与患者年龄有关，<60岁者MMP7表达明显高于≥60(u=2.401，P<0.05)，见表2。

　　2.3 MMP7与VEGF在大肠癌组织表达的相关性

　　VEGF与MMP7明显相关(r=0.245, P<0.05)，见表3。

　　3 讨论

　　3.1 VEGF在大肠癌生长及转移过程中的意义

　　本实验结果显示VEGF的表达与大肠癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移和Dukes分期呈正相关。有研究显示VEGF通过“旁分泌”方式刺激血管内皮细胞分泌纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶，参与细胞外蛋白水解和基底膜的降解，有利于血管床的延伸和内皮细胞的迁移，这样形成的肿瘤血表1 VEGF与大肠癌临床病理特征的关系管系统与正常血管相比高度紊乱，过度的分枝、管壁上大量的内皮孔道、囊泡、基底膜的缺失，使得肿瘤血管具有高度的通透性，肿瘤细胞极易穿透血管壁而发生远处转移。随着肿瘤体积的不断增大，浸润的不断加深，肿瘤内部产生的压力挤压肿瘤内部的淋巴管，而VEGF可使肿瘤组织外周的淋巴管扩张，更利于淋巴管收集间质液和从肿瘤表面渗出的脱落肿瘤细胞，促成了淋巴管转移[4]。此外VEGF还通过“自分泌”机制作用于肿瘤细胞上的Flk1刺激肿瘤细胞的生长[5]。Ochiumi T[6]、Lesslie DP[2]等研究提示VEGF可能调控大肠癌细胞的迁移和生存，Tsai[7]等研究认为术前血中VEGF水平与大肠癌的预后明显相关，本组研究结果证明VEGF不仅为肿瘤生长提供营养，同样也促进了肿瘤的转移。

　　3.2 MMP7在大肠癌生长及转移过程中的意义

　　本组资料显示81例大肠癌中79例MMP7阳性表达，其表达与大肠癌的淋巴结转移、远处转移、Dukes分期呈正相关，大肠癌细胞可能通过分泌MMP7直接破坏基底膜和肿瘤基质，浸润周围组织进而发生转移。Wang[8]等研究显示MMP7上调可增加肿瘤细胞对FasL引起的细胞凋亡的耐受性。Luo[9]、Pesta[10]等研究结果显示MMP7在直肠癌、大肠癌组织中的表达与mRNA一致，明显高于正常粘膜组织，在直肠癌的进展中具有一定作用，可作为评估病人预后的指标。Curran等[11]报道胃癌中MMP7水平的增高与该肿瘤的血道、淋巴道转移有显著的相关性。在肿瘤的分化程度一组中，高、中、低分化腺癌MMP7表达差别不明显，只有粘液腺癌MMP7的表达显著高于高分化腺癌，粘液腺癌中MMP7的高表达说明该肿瘤细胞可能具有更强的分泌MMP7的能力，具有更大的破坏力。国内对于大肠癌中MMP7的表达研究较少，以上结果与万远廉等[12]检测大肠癌中MMP7mRNA的结果基本一致。本实验还发现低年龄组大肠癌患者MMP7表达明显高于高年龄组，这在有关文献中未见报道，表明MMP7在年轻大肠癌患者的快速进展中扮演更重要的角色。MMP7在癌细胞胞核着色仅见郭颖[13]报道在卵巢交界性及恶性浆液性肿瘤中出现，我们的实验也发现5例大肠癌癌细胞胞浆和胞核均有着色。Zhao等[14]推测细胞核中有MMP，MMP7在肿瘤细胞核中定位的生物学意义尚不清楚。

　　3.3 MMP7与VEGF相关性的意义

　　VEGF与MMP7呈明显正相关，表明VEGF和MMP7在大肠癌的进展过程中具有协同作用，VEGF刺激内皮细胞分泌纤溶酶原激活剂和胶原酶，这些胶原酶中可能存在MMP7;MMP7对VEGF的直接影响未见报道，但MMP7降解基质的作用有利于肿瘤细胞生长，Mitsiades等[15]认为MMP7能降解细胞膜上的Fas配体，抑制Fas介导的细胞凋亡，促进肿瘤细胞的生长，可能间接促进了肿瘤细胞分泌VEGF。我们的研究结果大肠癌中VEGF与大肠癌浸润、淋巴结转移、远处转移、Dukes 分期有关，说明VEGF一方面促进了血管的新生，另一方面促进了肿瘤细胞的增殖和迁移，导致了肿瘤的浸润和转移。

　　MMP7、VEGF对肿瘤的生长、转移具有协同刺激作用，可作为评估肿瘤预后的指标，降低MMP7、VEGF的表达及活性可能成为抗肿瘤转移治疗的一个新途径。

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