人MT1H基因对肺腺癌细胞A549增殖的影响及其机制

　　作者：侯新芳，樊青霞，王留兴，王瑞林，陆士新，赵培荣 作者单位：1.450052 郑州大学肿瘤中心，郑州大学第一附属医院肿瘤科;2.中国医学科学院肿瘤研究所

　　【摘要】 目的 研究外源性人金属硫蛋白1H(MT1H)基因稳定转染对肺腺癌细胞A549生长的影响及其机制。方法 构建MT1H基因真核表达质粒pcDNA3.1()MT1H,以脂质体法转染A549细胞，经G418筛选，获得阳性单克隆细胞。用RTPCR和Western blot技术检测转染前后MT1H mRNA和蛋白表达，MTT实验检测其增殖能力的变化，流式细胞仪分析细胞周期时相分布。然后RTPCR检测cyclinD1的表达。结果 MT1H在A549细胞中获得表达。与未转染组和空质粒转染组比较，pcDNA3.1()MT1H转染组细胞增殖速度明显增快，G0/G1期细胞减少，S期细胞增多，cyclinD1 mRNA水平明显升高。结论 MT1H能够促进肺腺癌细胞A549增殖，可能和上调cyclinD1促使细胞进入S期增多有关。

　　【关键词】 肺癌;金属硫蛋白1H;细胞增殖;cyclinD1

　　The Effect of Human MT1H Gene on the Proliferation in Lung Adenocarcinoma Cell A549 and Its Mechanism

　　HOU Xinfang, FAN Qingxia, WANG Liuxing, WANG Ruilin, LU Shixin, ZHAO Peirong

　　1. Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China;2. Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Science　Corresonding Author：LU Shixin，Email：shlu@public.bta.net.cn

　　Abstract：Objective To investigate the effects of exogenous MT1H gene stably transfection on growth of lung adenocarcinoma cell A549 in vitro. Methods A recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1()MT1H was constructed and transfected into A549 cells by lipofectamine 2000. Positive monoclone was screened by G418. RTPCR and Western blot assays were used to identify the expression of MT1H mRNA and protein respectively. The cell proliferation was determined by MTT assay. The alterations of cell cycle were determined by flow cytometry (FCM).Then the expression of cyclinD1 mRNA was determined by RTPCR. Results MT1H mRNA and protein were expressed in A549 cells. Cells tranfected pcDNA3.1()MT1H compared with the control groups, proliferation rate significantly enhanced, cells number of G0/Gl phase obviously decreased while cells number of S phase increased, cyclin D1 mRNA levels elevated. Conclusion MT1H could promote proliferation of lung adenocarcinoma cell A549 by upregulating expression of cyclin D1 to facilitate cells into S phase.

　　Key words：Lung adenocarcinoma; MT1H; Cell proliferation; cyclinD1

　　0 引言

　　金属硫蛋白(MTs)是一类富含半胱氨酸，缺少芳香族残基的低分子量蛋白质。人MT基因位于染色体16q13，包括10个功能性基因和7个非功能性基因 [1]。功能性基因包括：MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3、MT4。目前很多研究发现MT和肿瘤发生发展有关 [2]。

　　ECRG2基因是通过mRNA差异显示技术，利用正常食管血组织和来自林县的三对高癌家族分离与鉴定的新基因 [3]。Cui Y等 [4]通过酵母双杂交技术发现ECRG2和MT1H有相互作用。进一步研究MT1H和ECRG2具体如何相互作用，首先需要明确MT1H的功能。本实验我们首先构建携带MT1H基因的重组真核表达载体pcDNA3.1/mychis()MT1H，然后对转染该基因的肺癌细胞A549的增殖特性进行了实验研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株、菌株和载体

　　肺腺癌细胞A549由本室保存。真核表达载体pcDNA3.1/mychis()B、DH5a菌株、含pACT2MT1H的DH5a菌株来自中国医学科学院肿瘤研究所病因室。

　　1.2 主要试剂

　　TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、XbaI和BamHI内切酶、100bp Ladder marker、DNA胶回收试剂盒、逆转录试剂盒均为Takara产品。LipofectamineTM 2000、TRIZOL均为Invitrogen公司产品。MTT为Sigma公司产品。鼠抗人His抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。引物由北京奥科生物公司合成。

　　1.3 目的基因的扩增

　　据MT1H全长cDNA序列及pcDNA3.1/mychis()质粒图谱，设计一对引物：P1：5′TGA TCT AGA ATG GAC CCC AAC TGC TCC 3′，在上游引物5′端引入XbaI酶切位点;P2：5′GAT GGA TCC GGC ACA GCA GCT GCA C 3′，在下游引物5′端引入BamHI酶切位点。以质粒pACT2MT1H为模板，扩增MT1HcDNA。PCR条件为：94℃变性30sec，56℃退火35sec，72℃延伸1min，共35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.4 pcDNA3.1()MT1H重组质粒的构建及鉴定

　　用XbaI、BamHI分别双酶切PCR扩增产物和pcDNA3.1()，1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收目的片段，于4℃在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，然后转化DH5a感受态细胞，筛选Amp抗性克隆，最后用PCR、双酶切、测序方法鉴定阳性克隆，命名为pcDNA3.1()MT1H。

　　1.5 细胞转染和阳性克隆筛选

　　参照LipofectamineTM 2000说明书，将pcDNA3.1()MT1H和pcDNA3.1()质粒转染人肺癌细胞A549中，48h后，将转染细胞按l：4传代，继续培养24h，换含G418 400μg/ml的培养液筛选2周。挑取单细胞阳性克隆继续在含G418 200μg/ml的培养液中扩大培养。分别命名为A549MT1H和A549空。

　　1.6 用半定量RTPCR和Western blot鉴定转染是否成功

　　1.6.1 RTPCR 收获对数生长期的A549、A549空和A549MT1H细胞。用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量与纯度。用AMV逆转录酶制备cDNA，取cDNA进行PCR扩增。MT1H引物为P1：5′CCA GTC TCA CCT CGG CTT G 3′;P2：5′TAG CAA ATG AGT CGG AGT TGT 3′，扩增片段294bp。βactin引物为：P1：5′CAT CCT GCG TCT GGA CCT 3′;P2：5′TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3′，扩增片段480bp。扩增条件为：94℃ 2min;94℃ 30sec，54℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环;72℃ 5min。取10μl扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.6.2 Westem blot 收集细胞，加入RIPA细胞裂解液裂解细胞，Bradford法测蛋白浓度。样品加入5×蛋白上样缓冲液混合，煮沸5min，取等量蛋白上样进行SDSPAGE电泳;电泳后，将蛋白转移至0.2μm PVDF膜，丽春红染色，5%脱脂奶粉封闭;随后加入鼠抗人his抗体，4℃孵育过夜;加HRP标记二抗，作用1h,然后DAB显色。

　　1.7 MTT法绘制细胞生长曲线

　　取对数生长期细胞，用0.25%的胰酶消化后计数，按每孔2×104个细胞接种于96孔培养板，每组设6个平行孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养。每天取出一块培养板，每孔加5mg/ml MTT10μl，继续培养4h后弃培养液，每孔加150μl DMSO,于振荡器振荡10min后用酶标仪570nm处测OD值，取6个孔的平均值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标作图。

　　1.8 流式细胞术检测MT1H对细胞周期的影响

　　收集对数生长期细胞，经胰酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，PI染色，上样于流式细胞仪。

　　1.9 RTPCR检测cyclinD1的表达

　　操作步骤同1.6.1。cyclinD1引物为：上游：5′CCA GTG ACA AAC CAT CCA GT 3′;下游：5′GGA TAT TCC CAA ACC ATT C 3′，扩增片段为371bp。βactin引物为：上游：5′GTG GGG CGC CCA GGC ACC AC 3′;下游：5′CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TT 3′，扩增片段为500bp。扩增条件为：94℃ 2min;94℃ 50sec，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环;72℃ 10min。

　　1.10 统计学分析

　　实验数据以±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行方差分析或t检验。

　　2 结果

　　2.1 pcDNA3.1()MT1H真核表达载体构建结果

　　将pcDNA3.1()MT1H重组质粒用XbaI和BamHI双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果显示两条带，分别为5.4kb和192bp,与pcDNA3.1()和MT1H的大小一致，见图1。将pcDNA3.1()MT1H阳性重组子进行DNA测序，测序结果与Genbank中的MT1H基因cDNA序列完全吻合。说明pcDNA3.1()MT1H真核表达载体构建成功。

　　2.2 RTPCR检测MT1H mRNA的表达

　　A549MT1H细胞扩增出大小为480bp的βaction条带和294bp的特异目的条带，而A549和A549空细胞仅扩增出大小为480bp的βaction条带，未扩增出目的条带，表明MT1H已成功转染A549细胞，见图2。

　　2.3 Western blot检测带His标签的MT1H融合蛋白表达

　　A549MT1H细胞提取总蛋白中检测出一条特异性目的条带，而A549空细胞未检测出目的条带。证明稳定转染MT1H基因的A549MT1H细胞中有带His标签的MT1H融合蛋白表达，见图3。

　　2.4 细胞生长曲线

　　MTT结果表明，与A549和A549空细胞相比，A549MT1H细胞增殖速度明显增快。MT1H对A549细胞增殖的影响从第3天开始具有显著差异(P<0.05)，见图4。

　　2.5 MT1H对A549细胞周期的影响

　　A549MT1H细胞与A549和A549空细胞比较，G0/G1期细胞明显减少，S期明显增多，见表1。表1 MT1H对A549细胞周期的影响(略)

　　2.6 MT1H对A549细胞cyclinD1表达的影响

　　A549空和A549MT1H细胞cyclinD1mRNA表达分别为0.27±0.047、0.52±0.060，与A549空相比，A549MT1H细胞cyclinD1表达明显升高(P<0.05)，见图5。

　　3 讨论

　　自从1957年Margoshes和Vallee 等从蓄积镉的器官马肾中分离出MT以来，MT引起大家极大的关注 [5]。MT具有特殊的生理功能, 可以和亲电子金属、氧自由基以及某些细胞代谢产物结合, 参与有机体的生理和病理过程。近年来，MT和疾病特别是肿瘤的关系成为研究热点。MT参与肿瘤细胞凋亡、增殖、肿瘤血管形成以及化疗耐药，影响治疗和预后 [2]。但是目前对MT异构体了解还很少。Friedline [6]等通过比较4株乳腺癌细胞MT异构体mRNA表达发现，MT1E只在雌激素阴性细胞株中表达不在雌激素阳性细胞株表达。Garrett和Somji等 [7，8]发现MT1X在进展期前列腺癌中表达下调，而在膀胱癌中上调。Jin等 [9]发现MT1F在3级分化的乳腺导管癌中显著升高。Volkan Gurel等 [10]证实不同MT异构体对不同肿瘤细胞增殖影响不同，稳定转染MT3能抑制MCF7和Hs578T细胞株增殖，但不抑制细胞株T47D or和MDAMB231增殖。MT1E转染却对以上四株细胞生长均不影响。这提示各种MT异构体功能可能存在差异，在不同细胞和组织，各种异构体承担着不同的作用。早在1988年Kgi和Schaffer [11]就指出不同金属硫蛋白异构体在人发育或在不同生理条件下可能功能不同。Bylander等 [12]也推测各种MT异构体有独特的功能。但是各种异构体的具体功能如何，它们功能存在差异的原因是什么，均需要进一步研究。这对了解MT在肿瘤发生发展中的作用具有重要意义。

　　本实验主要目的是了解MT异构体1H对人肺腺癌细胞A549生长的影响及其机制。我们实验结果表明，采用脂质体介导的转染技术增强肺癌细胞A549中MT1H表达，可明显促进A549增殖，G0/G1期细胞减少，S期细胞增多。进一步检测cyclinD1表达的变化，发现A549MT1H细胞cyclinD1表达明显高于A549-空细胞。cyclinD1是重要的细胞周期调控蛋白, 主要功能是促使细胞通过G1/S限制点进入S期。其表达失控时, 将引起细胞周期失调，导致细胞增殖和凋亡失衡，可促使细胞恶性转化 [13]。因此，MT1H促进肺腺癌细胞A549增殖，可能和上调cyclinD1促使细胞进入S期增多有关，其确切机制还需要进一步研究。本实验为进一步研究MT1H的分子生物学特性提供了实验依据，为深入探讨MT1H的作用机制和与其他基因的相互作用奠定了基础。至于MT1H是否对肺癌细胞其他生物学行为有影响以及相关传导路径，有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

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　　[10]Volkan Gurel, Donald A，Sens,et al. Stable Transfection and Overexpression of Metallothionein Isoform 3 Inhibits the Growth of MCF7 and Hs578T Cells but not that of T47D or MDAMB231 Cells [J]. Breast Cancer Res Treat, 2003, 88(2):181191.

　　[11]Kgi JHR, Schaffer A. Biochemistry of metallothionein [J]. Biochemistry, 1988, 27(23): 85098515.

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