去甲斑蝥素对不同肿瘤细胞系作用的研究现状

　　作者：原江亮 作者单位：晋煤集团总医院(048006)

　　【关键词】 去甲斑蝥素 肿瘤细胞系 研究现状

　　人类用斑蝥治疗疾病已有两千多年的历史,斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥虫体,在《本经》中称其性味辛、寒,有大毒,归肝、肾、胃、大肠、小肠经,具有攻毒蚀疮,逐瘀散结的功效。斑蝥抗癌的主要有效成分为斑蝥素,对原发性肝癌等有一定疗效，但由于其对泌尿系统的强烈刺激性限制了其在临床上的应用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)系斑蝥素的衍生物，是从斑蝥中提取斑蝥素并经人工合成的一种新型低毒的抗癌药物，基本消除了对泌尿系统的刺激性，保留了抗癌和升高白细胞的作用[1]，它不仅对原发性肝癌及一些消化道肿瘤有疗效，而且对乙型肝炎[2]、银屑病[3]有一定的治疗作用，是当今国际上第一个具有升高白细胞的抗癌药物。

　　1. 去甲斑蝥素与人肝癌细胞BEL-7402系

　　去甲斑蝥素治疗原发性肝癌可使患者食欲增加，腹胀、肝区疼痛减轻或消失，生存期明显延长。孙震晓等通过细胞的形态学观察和DNA琼脂糖凝胶电泳等方面，考察了去甲斑蝥素作用于人肝癌细胞BEL-7402系的特点。结果显示，10 mg/L去甲斑蝥素作用于BEL-7402细胞24 h后，光镜和电镜下都可见到细胞凋亡的表现。通过DNA琼脂糖凝胶电泳，在10 mg/L去甲斑蝥素作用于BEL-7402细胞24 h后,可见以约200 bp为基数的DNA片断组成的“梯状”带纹 (ladder)。免疫细胞化学及Western blotting分析显示该过程伴随癌基因蛋白Bcl-2表达的减弱[4]。实验表明,去甲斑蝥素可诱导人肝癌细胞凋亡，其过程可能与癌基因蛋白 bcl-2表达下凋有关。戴书静等人进一步通过实验证实,去甲斑蝥素对人肝癌细胞株生长的抑制作用机制可能与其能增强核转录因子kappa B(NF-κB)的抑制分子IκBα的表达有关[5]。

　　2 去甲斑蝥素与人原发性胆囊癌GBC-SD系

　　胆囊癌手术切除率低，术后易复发、转移，对化疗、放疗不敏感，患者预后差。国内已有多人用去甲斑蝥素对人胆囊癌细胞系GBC-SD进行了相关研究。范跃祖[6]等通过四氮唑盐比色(MTT)法、流式细胞术、光电显微镜研究了去甲斑蝥素对原发性胆囊癌GBC-SD细胞系增殖和凋亡的影响，结果显示：NCTD浓度为10 μg/mL时,对GBC-SD细胞的生长有抑制作用,且随药物浓度升高其抑制作用增强,呈剂量-效应关系;NCTD对GBC-SD细胞的半数抑制浓度(IC50)为 60 μg/mL，48 h时抑制作用最明显,呈时间-效应关系;流式细胞仪显示:G2+M期的细胞明显增多,S期细胞明显减少,细胞凋亡率上升;光电显微镜下都可见到凋亡小体[7，8]。PCNA和Ki-67蛋白为细胞增殖的指标，其表达的强弱多寡反映了细胞的增殖情况[5，6]。傅锦业等进一步应用SABC法探讨了去甲斑蝥素对人胆囊癌GBC-SD细胞系增殖相关基因蛋白PCNA、Ki-67的影响，结果显示：去甲斑蝥素 (60 μg/mL)作用48 h后,PCNA表达和Ki-67表达阳性的细胞数明显减少，与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)[9] 。实验证明，NCTD能抑制人胆囊癌GBC-SD细胞系的生长，并且可能是通过影响GBC-SD细胞增殖相关基因蛋白PCNA和Ki-67的表达来抑制人胆囊癌PCNA的细胞增殖。

　　癌细胞侵袭能力是恶性肿瘤的基本特征之一，初始基本步骤即是具有极强侵袭能力的癌细胞突破正常细胞基底膜，并在别处形成转移灶。其中，细胞外基质 (ECM)的降解和基底膜 (BM)的破坏是一个关键步骤，而基质金属蛋白酶 (MMPs)及其组织抑制因子(TIMPs)家族是其中关键因素之一，MMP2、TIMP2则是这两个家族中具有代表性的两个因子[10～12]。范跃祖等运用Matrigel侵袭实验、过河实验和SABC法进一步研究了NCTD对GBC-SD细胞的侵袭力和对MMP2、TIMP2蛋白表达的影响。在Matrigel侵袭实验中，NCTD可明显抑制GBC-SD细胞的体外模拟基底膜侵袭,其抑制作用呈剂量-效应关系;在NCTD对GBC-SD细胞迁移运动能力的影响中，NCTD可明显抑制GBC-SD细胞的迁移运动能力。在NCTD对GBC-SD细胞MMP2、TIMP2和MMP2/TIMP2的影响中，对照组MMP2多呈阳性表达,TIMP2呈阴性;NCTD作用后,MMP2阳性表达细胞减少,TIMP2阳性表达细胞增多，MMP2/TIMP2比值降低(P<0.05)[13]。因此，去甲斑蝥素抑制GBC-SD细胞的侵袭和运动能力的机制可能与干扰GBC-SD细胞的MMP2分泌、增加TIMP2表达，维持MMP2/TIMP2动态平衡,减少ECM和BM降解破坏有关。

　　赵泽明[14]等通过建立人原发性胆囊癌GBC-SD细胞裸鼠胆囊癌移植瘤动物模型，从对移植瘤体积的影响、移植瘤瘤周侵袭和肺转移的影响及对裸鼠移植瘤转移相关基因蛋白nm32、MMP2和TIMP2的影响进一步进行研究。结果显示，NCTD对胆囊癌移植瘤的增殖有明显的抑制作用,且对移植瘤瘤周侵袭和远处肺转移亦有明显抑制作用，nm32基因蛋白在NCTD作用下阳性表达率增高，在体内证明了NCTD对胆囊癌GBC-SD细胞系的抑制作用[12]。

　　3 去甲斑蝥素与白血病各细胞系的相关研究

　　3.1. 去甲斑蝥素与人红白细胞K562细胞系

　　药理实验及临床实践表明,NCTD对正常骨髓细胞没有抑制作用,反而有很好的升白效果[15]。陈家旭等[16]探讨了去甲斑蝥素对人白血病细胞株K562细胞增殖的抑制作用。结果显示，NCTD对K562有较强增殖抑制作用，呈时间和剂量效应关系，电泳结果可见DNA“梯子”，流式细胞术显示NCTD作用后呈现G2+M期阻滞现象。孙震晓等应用免疫细胞化学进一步探讨了去甲斑蝥素作用于人红白血病 K562细胞凋亡相关基因蛋白的表达，结果显示：10 μg/mL NCTD处理K562细胞24 h,bcl-2蛋白表达减弱,而Bax蛋白表达增强[17]。Oltvai等的实验证实,Bax过量表达,则bcl-2被抑制,凋亡被诱导,细胞死亡[18]。因此，可以说明NCTD可诱导人红白血病K562细胞凋亡，bcl-2蛋白表达减弱及Bax蛋白表达增强可能在NCTD诱导K562细胞凋亡过程中起协同作用。

　　3.2. 去甲斑蝥素与人早幼粒白血病细胞株HL60细胞

　　用放射性核素示踪技术研究了去甲斑蝥素与人早幼粒白血病细胞株HL60细胞的关系。结果显示，在NCTD作用下，从3H-TdR掺入的动力学过程可以看到，作用在6 h内不受影响，6 h后开始受到抑制，24 h以后逐渐趋于平稳。同时NCTD对HL60细胞的蛋白质合成亦有显著抑制作用，提示NCTD 作用的早期环节可能还不完全是DNA合成代谢系统，蛋白质合成的抑制可能是NCTD抑制肿瘤细胞增殖的原因之一[19]。刘晓兰等运用流式细胞术探讨了去甲斑蝥素 (NCTD)对人早幼粒白血病细胞株HL60细胞增殖的抑制作用，证实了NCTD对HL60细胞有较强增殖抑制作用,且有时间和剂量效应关系，并且其抑制作用是通过干扰该细胞的增殖与诱导细胞凋亡来实现的[20]。

　　3.3. 去甲斑蝥素与人T淋巴细胞白血病细胞株6T-CEM

　　黄雪强等通过TUNEL标记、DNA凝胶电泳以及光镜技术探讨去甲斑蝥素诱导人T淋巴细胞白血病细胞株(6T-CEM)凋亡的规律。结果提示：去甲斑蝥素具有明显诱导细胞凋亡作用，小剂量去甲斑蝥素刺激细胞生长，而一定范围剂量的去甲斑蝥素可在直接杀伤作用较小的情况下明显诱导6T-CEM)细胞凋亡,不会因细胞坏死而引起炎症反应[21]。这对于去甲斑蝥素应用于临床特别是肿瘤的治疗将有十分重要的意义。

　　4. 去甲斑蝥素与人黑色素瘤A375-S2细胞系

　　近年来Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡研究的热点，Caspase被认为是执行细胞凋亡的主要酶类。与Caspase有关的凋亡通路至少有三种:线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路[22]。在去甲斑蝥素诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡中，运用MTT法、DNA凝胶电泳及Westerm blot检测法，探讨了半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-3、8、9在去甲斑蝥素诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡中的作用。结果显示NCTD (60 μmol/L)对A375-S2细胞给药后可明显增强Caspase-3、9的酶活力，且呈一定的时间依赖性，但Caspase-8的酶活力仅在给药后28 h有一定的升高。同时，Bcl-2/Bax或Bcl-x L/Bax的蛋白表达比率在给药后明显降低[23]。实验结果提示细胞膜死亡受体相关的Caspase信号转导途径可能与NCTD诱导A375-S2细胞凋亡无关，而可能激活了线粒体途径参与诱导细胞凋亡作用。

　　5. 去甲斑蝥素与小鼠肺纤维瘤L929细胞系

　　丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)在介导细胞信号转导中发挥重要作用。目前所知MAPK超家族包含三条平行的MAPK级联反应: ERK、JNK/SAPK、P38MAPK途径，以高度保守的三级激酶级联的形式(MAPKKK-MAPKK-MAPK)转导信号。安巍巍等运用免疫印迹法(Western blot)在去甲斑蝥素诱导小鼠肺纤维瘤L929细胞凋亡的实验中分析了细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷酸化ERK、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)和磷酸化JNK蛋白表达的变化。结果显示：PD98059(ERK抑制剂)和SP600125(JNK抑制剂)可以显著抑制NCTD对L929细胞的凋亡作用，且在NCTD作用后磷酸化ERK和磷酸化JNK的蛋白量增加，提示ERK和JNK的磷酸化作用可能参与了NCTD诱导L929细胞凋亡的作用。研究还发现，药物作用48 h后磷酸化ERK的蛋白量恢复到给药前水平，推测在此时间后可能有其它凋亡机制参与了NCTD诱导L929细胞凋亡作用[24]。由实验结果推断ERK、JNK激酶在L929细胞凋亡过程中可能均被激活，共同参与了NCTD对L929细胞的细胞毒作用。

　　6 展望

　　去甲斑蝥素是一种新型抗肿瘤药物，临床上主要用于原发性肝癌的治疗。由于它升高白细胞的作用是其它抗癌药所不具有的，研究者一直未放弃对它的研究。目前已经认识到，它不仅对原发性肝癌，而且对胃癌、食管癌等其它消化道肿瘤和乙型肝炎、银屑病有一定的治疗作用，实验室也通过对其它类型肿瘤细胞系的抑制作用进一步证明了它的抗癌活性。相信随着研究的不断深入，将会从分子水平进一步阐明它的作用机理。

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