当归多糖对HBV转基因小鼠树突状细胞作用

　　作者：沈晓燕，侯安继Δ，胡 艳，张红卫，周 维 作者单位：200137 上海，上海市第七人民医院肿瘤科(Δ通讯作者)

　　【摘要】 目的 研究当归多糖对HBV转基因小鼠免疫调节作用。方法 采用1%当归多糖(ASP)腹腔注射，每周2次，2周后摘取小鼠脾脏制备淋巴细胞，MTT(噻唑蓝粉剂)法观察ASP对淋巴细胞的毒性作用;经粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)培养转基因小鼠脾脏来源树突状细胞(DC)，ELISA法检测DC分泌IL-12以及刺激混合淋巴细胞反应T淋巴细胞分泌IL-10、IFN-γ的含量。结果 ASP在0～625 mg/L浓度对HBV转基因小鼠无毒性作用，并能显著促进HBV转基因小鼠DC分泌IL-12，在混合淋巴细胞反应中，能有效促进T淋巴细胞分泌IFN-γ并抑制IL-10的分泌，从而上调DC功能。结论 当归多糖对HBV转基因小鼠树突状细胞功能具有上调作用，可能是当归多糖免疫调节机制之一， 为当归多糖在慢性乙型肝炎临床应用提供了实验依据。

　　【关键词】 当归多糖;HBV转基因小鼠;树突状细胞;慢性乙型肝炎

　　Experimental study of Angelica sinensis polysaccharide (ASP) on the function of dendritic cells in HBV transgenic mice

　　SHEN Xiao-yan, HOU An-ji, HU Yan,et al. Department of Oncology, Shanghai No.7 People’s Hospital, Shanghai 200137, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of Angelica sinensis polysaccharide (ASP) on the function of dendritic cells(DCs) in HBV transgenic mice. Methods ASP of 1% concentration was given to HBV transgenic mice by abdominal injection twice a week. After 2 weeks, spleens were harvested to make lymphocytes. MTT method was used to detect ASP’s cytotoxicity. Dendritic cells were separated from lymphocytes and incubated with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GMC-SF)and interleukin-4(IL-4). Phenotype of DCs were assayed by flowcytometry(FCM), IL-12 released by DCs and IL-10 and IFN-γ produced by T cells in mixed lymphocyte reaction(MLR) were measured by ELISA. Results ASP within the concentrations of 0-625mg/L didn’t show cytotoxicity to lymphocytes, ASP could enhance DCs’ secretion, increase IL-12 level in HBV transgenic mice , increase the secretion of IFN-γ, inhibit the secretion of IL-10 in MLR, thus up-regulates DC’s function. Conclusion ASP could up-regulate dendritic cells function in HBV transgenic mice that might be one mechanism through which polysaccharide regulate immune function. Our experiment results provided experimental evidence for the use of ASP in CHB clinic.

　　【Key words】 Angelica sinensis polysaccharide (ASP); HBV transgenic mice; dendritic cell; chronic hepatitis B

　　慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者免疫功能低下，不能有效清除乙型肝炎病毒(HBV)，机体对HBV呈现免疫耐受状态[1]。树突状细胞(dendritic cell, DC)是已知人体内功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。近年研究表明，CHB患者DC功能处于抑制状态，如何解决DC功能的低下状态成为国内外研究的热点，多糖类中药如香菇多糖等已被公认具有较好的免疫调节作用并广泛用于CHB和肿瘤的辅助治疗[2]，鉴于多糖类中药良好的免疫调节作用，理论上推测其对DC应有一定的调节作用，但迄今 为止有关多糖对DC功能影响的报道尚不多见，因此，开展多糖类中药对DC影响的研究不仅开拓了多糖类研究的新领域，也有望为解决DC功能抑制提供安全实用的新制剂。

　　当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是中药当归的提取物，研究证实ASP具有较好的免疫调节作用和抗肿瘤作用，笔者曾报道羧甲基茯苓多糖(CMP)能上调DC功能[3]，但ASP对DC的影响如何，相关报道甚少，因此本研究中，笔者利用HBV转基因小鼠作为动物模型，经ASP腹腔注射处理后，观察ASP对DC的作用及其与Th1/Th2分化的关系，以探讨多糖类中药对HBV感染模型动物DC的影响，为临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与药物 当归多糖(ASP)由武汉大学中南医院药学部刘萍主任药师提供，用前以D-Hank’s液稀释至所需浓度;丝裂霉素C、二甲基亚砜粉剂(DMSO)为美国Sigma公司出品，RPMI1640培养液、 胎牛血清液(fetal calf serum，FCS)为美国GIBCO公司出品, L-谷氨酰胺粉剂为美国Amresco 公司出品，植物血凝素(PHA)购自北京大学医学部，噻唑蓝粉剂(MTT)为荷兰Duchefa公司出品，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)为以色列CytoLab/Peprotech Asia公司出品，FITC-CD80单克隆抗体、PE-CD11c单克隆抗体为美国BioLegend公司产品，PE-MHCⅡ单克隆抗体为美国eBioscience公司产品，IL-12、IL-10、IFN-γELISA双抗体夹心定量检测试剂盒为美国Biosource公司产品，IFN-α为深圳科兴生物公司产品，其他常用生化试剂均为国产分析纯。

　　1.2 实验动物、分组及处理方法 HBV转基因小鼠共15只，由北京大学医学部实验动物中心提供，携带有HBV pre-S、S和X基因，品系：C57BL/6J-TgN(Alb1 HBV)44Bri，雄性，体重20±2g。按完全随机分配到ASP组、IFN-α组和空白对照组,每组各5只, ASP组采用1% ASP溶液腹腔注射, 0.5 ml/20g体重, 每周2次, 连续注射2周, IFN-α组给予α-2b干扰素, 2500 u/20g体重, 空白对照组给予等容量的生理盐水。

　　1.3 DC的分离、纯化与培养 按文献[4]方法进行。最后一次腹腔注射后3天颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡3min，无菌取脾，用Hank’s液洗两遍，将脾研碎，200目尼龙膜过滤，低渗法去除红细胞，加入RPMI 1640完全培养液制备脾单个核细胞悬液，置于37℃ 5% CO2 培养箱中孵育3h, 轻轻晃动培养板，此时吸去悬浮细胞为淋巴细胞，用RPMI 1640培养液轻轻漂洗培养板2次，此时附着在培养板中的粘附细胞大多为单核细胞。镜下细胞计数，加入RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至106/ml，并加入细胞因子GM-CSF(25μg/L)和IL-4(25 μg/L)，置37℃ 5% CO2 培养箱中培养，隔天半量换液，加半量细胞因子(12.5μg/L)，培养至第7天，即得到成熟DC。

　　1.4 ASP对小鼠脾淋巴细胞毒性试验 无菌取出HBV转基因小鼠脾脏，按上述方法制备脾单个核细胞悬液，置于37℃ 5% CO2 培养箱中孵育3h, 取上清，调整细胞浓度为105/ml，加入96孔板100 μl/孔，再加入不同浓度ASP 10μl，空白对照组用等体积的RPMI 1640培养液代替。ASP的终浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.0625 、0 mg/L。每浓度组设3个复孔，37℃ 5% CO2 培养箱中孵育20h, 加入MTT 10μl/孔, 37℃ 5% CO2 培养箱中继续孵育4h, 弃去上清， 加DMSO 100 μl/孔，5min后，置于酶标仪570nm处测A值，细胞杀伤率(%)=(实验组平均A值-空白对照组A值)/(细胞对照组A值-空白对照组A值)×100%。

　　1.5 流式细胞仪检测DC 按前述方法制备成熟DC细胞，调整细胞浓度至106/ml，吸入2ml至试管，9500 r/min离心5min，用pH 7.4 D- Hank’s液洗2次，吹打均匀，分别加入FITC-CD80、PE-CD11c、PE-MHCⅡ单抗置4℃30 min，用pH 7.4 D- Hank’s液洗1次，流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析。

　　1.6 ASP对DC分泌细胞因子IL-12的影响 按前述方法制备脾单个核细胞悬液，置于37℃ 5% CO2 培养箱中孵育3h, 轻轻晃动培养板，吸弃悬浮细胞，RPMI 1640培养液轻轻漂洗培养板2次，RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至106 /ml，加细胞因子GM-CSF(25μg/L)和IL-4(25μg/L)，再分别加入IFN(终浓度1000u/ml)、ASP(终浓度156.25mg/L)，对照组用等体积的RPMI 1640代替，置37℃ 5% CO2培养箱中培养，隔天半量换液，加半量细胞因子(12.5μg/L)，培养至第7天，留取培养细胞上清液，-20℃冻存待测IL-12。

　　1.7 混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR) 无菌取脾，按前述方法制备成熟DC细胞，按文献[5]方法，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至105/ml，37℃5% CO2培养箱中孵育24h，分别加入终浓度为25mg/L丝裂霉素C，37℃ 5% CO2培养箱中孵育45min，9500r/min 离心5min，弃上清，用RPMI 1640培养液洗涤细胞2次，调整细胞数至104/ml作为刺激细胞;再无菌取出小鼠脾脏，按前述方法制备淋巴细胞作为反应细胞，调整细胞数至105/ml。两种细胞按1：1体积混合，充分混匀后在96孔板中每孔加入100μl混合细胞悬液，再加入PHA 10 μl(终浓度为10mg/L)，对照组用等体积的RPMI 1640培养液代替，37℃5% CO2培养箱中培养6天，沉淀细胞，留取上清液，-70℃冻存待测IL-10和IFN-γ，沉淀细胞加入MTT液(5 g/L) 20μl/孔，37℃ 5% CO2培养箱中继续培养5～8h，每孔加入酸化异丙醇100μl，振荡5 min，ELISA法检测。

　　1.8 细胞因子IL-12、IL-10和IFN-γ的检测 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ABC-ELISA)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

　　1.9 统计学分析 所有实验数据以均值±标准差(x±s)表示，使用SPSS11.5统计软件分析，多组间的数据比较用方差分析，P<0.05差异有显著性。

　　2 结果与讨论

　　2.1 ASP对小鼠脾淋巴细胞毒性试验 采用MTT法，结果显示，当ASP终浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.0625 、0mg/L时，细胞杀伤率分别为(29.8±0.5)%、(65.5±9.3)%、(71.5±3.6)%、(89.6±4.3)%、(93.4±3.6)%、(135.5±14.2)%、(76.5±6.3)%、(77.8±4.8)%、(79.4±3.2)% 。细胞毒性试验结果表明，ASP浓度在0～625mg/L时对转基因小鼠脾淋巴细胞无毒性作用，在156.25mg/L时对淋巴细胞的保护作用最强，95%的可信限为：0～2000mg/L，说明该多糖对小鼠脾淋巴细胞是安全的。

　　2.2 转基因小鼠DC的流式细胞仪检测 表1中CD80+、CD11c+、CD80+CD11c+ 或CD80+ 、MHC-Ⅱ+、CD80+ MHC-Ⅱ+分别为PE和FITC两次标记所得到的单阳或双阳性流式细胞检测数据，从表1中可以看出，HBV转基因小鼠无论是CD80+CD11c+或是CD80+ MHC-Ⅱ+均处于低表达状态。从中可见对照组各指标均较低，说明转基因小鼠DC表型低表达，而ASP组和IFN组均能有效提高转基因小鼠DC表型的表达，ASP组与对照组、IFN与对照组比较，差异均存在极显著性(P<0.01)，而ASP与IFN组之间，差异无显著性(P>0.05)。 表1 ASP对转基因小鼠树突状细胞CD80、CD11c、MHC-Ⅱ作用的流式细胞仪检测数据注：与空白对照组比较，**P<0.01

　　Th1和Th2两个亚群由CD4+ T细胞分化而来， Th1型细胞因子主要包括IL-2、IL-12、IL-18、IFN-γ和TNF-β等,通过促进NK、CTL及巨噬细胞活化、增殖,介导细胞毒效应和局部炎症有关的免疫应答,在抗HBV感染过程中发挥重要作用。Th2型细胞因子主要包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等,其主要功能在于刺激B细胞增殖及嗜酸性粒细胞活化,并产生抗体,参与体液免疫。Th1细胞和Th2细胞及其分泌的细胞因子共同调节机体的免疫应答过程,二者相互抑制,相互调节,保持动态平衡状态,在有抗原持续存在且不易清除的慢性疾病中，Th0细胞分化为Th1或Th2细胞具有明显的倾向性。DC能有效活化Th0，具有超强的抗原提呈效率，目前普遍认为，DC功能缺陷是造成CHB患者体内缺乏有效的CTL应答的主要原因，未成熟DC在捕捉HBV后向外周淋巴组织的T 细胞区迁移能力下降，CD40低表达,T细胞活化受阻, DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD1a及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR 低表达，体外刺激T淋巴细胞增殖的能力降低，在DC培养上清液中IL-12水平下降[6]。本文的实验结果发现HBV转基因小鼠DC表型低表达，DC功能低下，从而进一步证实了上述研究结论，而AP和IFN对低表达的DC表型有一定的上调作用。

　　2.3 细胞因子含量检测 从表2中可见，ASP组IL-12和IFN-γ分泌显著高于对照组(P<0.05)、 与IFN组比较则差异无显著性(P>0.05); ASP组分泌IL-10显著低于对照组(P<0.05)、与IFN组比较则差异无显著性(P>0.05)，说明ASP和干扰素-α均可促进HBV转基因小鼠IL-12和IFN-γ的分泌，抑制IL-10的分泌。 表2 细胞因子检测结果 注：与对照组比较,*P<0.05

　　2.4 细胞因子之间的相关性 表3可见， IL-12和IFN-γ之间具有显著的正相关性(P<0.05);而IL-12和IL-10之间与IL-10和IFN-γ之间的相关性都不显著(P>0.05)。 表3 转基因小鼠细胞因子之间的相关性分析当归多糖的免疫调节作用已有报道，李杰等[7]报道ASP不仅能激活T、B淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等免疫细胞，还能促进细胞因子生成，激活补体系统，促进抗体产生，对免疫系统发挥多方面的调节作用。本实验中，将ASP作用于HBV转基因小鼠，观察其脾脏来源DC分泌细胞因子IL-12的变化以及刺激混合淋巴细胞反应分泌IL-10与IFN-γ的变化，以了解ASP对DC抗原提呈功能缺陷的影响。

　　研究结果显示，由于DC表面共刺激分子CD80及 MHC-Ⅱ类分子低表达，体外刺激T淋巴细胞增殖的能力降低，DC培养上清液中IL-12及MLR上清液中IFN-γ水平下降，IL-10水平升高，Th1/Th2细胞因子失衡，这有助于解释为什么CHB患者体内HBV持续存在。ASP对转基因小鼠脾脏来源DC分泌IL-12、MLR中T细胞分泌IFN-γ具有促进作用，而对IL-10的分泌具有抑制作用，且IL-12和IFN-γ之间具有显著的正相关性，说明ASP具有纠正Th1/Th2比例失衡、上调DC功能的作用，这一结果与笔者近期报道的羧甲基茯苓多糖上调DC功能的作用相似[8]，说明上调DC功能可能是多糖类药物免疫调节的重要作用机制之一。虽然本实验提示了ASP在慢性乙肝临床的应用前景，但这一研究还只是初步的，需要进一步的深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Beckebaum S, Cicinnati VR, Dworacki G, et al. Reduction in the circulating pDC1/pDC2 ratio and impaired function of exvivo-generated DC1 in chronic hepatitis B infections. Clin Immunol, 2002, 104: 138-150.

　　2 许杜鹃，陈敏珠. 黄芪多糖的抑瘤作用及其机制. 中国医院药学杂志, 2005, 25(10): 923-925.

　　3 侯安继，杨占秋，黄菁，等. 羧甲基茯苓多糖上调HBV转基因小鼠树突状细胞功能. 武汉大学学报(理学版)，2006, 51(6): 778-782.

　　4 Lunga TL, Saurwein-Teissla M, Parsonb W, et al. Unimpaired dendritic cells can be derived from monocytes in old age and can mobilize residual function in senescent T cells. Vaccine，2000,18:1606-1612.

　　5 Dakic A, Shao QX, D’Amico A, et al. development of the dendritic cell system during mouse ontogeny. J Immunol, 2004, 172: 1018-1027.

　　6 Wattegedera S, Sills K, Howard CJ, et al. Variability in cytokine production and cell proliferation by mitogen-activated ovine peripheral blood mononuclear cells:modulation by interleukin (IL)-10 and IL-12. Veterinary Immunology and Immunopathology，2004,102: 67-76.

　　7 李杰，张楚善.中药多糖的免疫调节及抗肿瘤作用.中国兽医杂志，2004，40(11)：31-33.

　　8 Hou Anji, Yang Zhangqiu, Huang Jing，et al. Carboxymethytl pachymaram up-regulates dendritic cells’ function in hepatitis B virus transgenic mice in vitro. WUJNS，2007, 12(3)：372-378.