大肠腺癌中基质金属蛋白酶2、9及其抑制剂1、2的表达

　　作者：陈谦，柯 娟，王纪全，邓怀慈 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤放疗科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨人大肠腺癌组织中基质金属蛋白酶2、9(MMP2、9)及其抑制剂1、2(TIMP1、2)的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测MMP2、MMP9和TIMP1、TIMP2在30例大肠腺癌组织及相应切缘正常组织中的蛋白表达。结果 大肠腺癌组织中MMP2、MMP9及TIMP1的阳性表达明显高于正常切缘组织(P<0.05)，并与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期以及淋巴结转移呈正相关(P<0.05);TIMP2在大肠腺癌组织中低表达(P<0.05)，并与浸润深度、Dukes分期以及淋巴结转移呈负相关(P<0.05)，与肿瘤分化程度无明显相关性(P>0.05);MMP9和TIMP1表达明显相关(r=0.4924, P<0.05)。结论 MMP2、MMP9及TIMP1的过度表达与大肠腺癌的侵袭、转移有密切关系，其联合检测有助于评估大肠腺癌的恶性生物学行为及预后。

　　【关键词】 大肠癌;基质金属蛋白酶;组织金属蛋白酶抑制剂;免疫组织化学

　　Expressions of MMP2/MMP9 and TIMP1/TIMP2

　　in human colorectal cancerCHEN Qian, KE Juan, WANG Jiquan, DENG Huaici

　　(Department of Oncology Radiotherapy, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To study the expressions of matrix metalloproteinase2 (MMP2), matrix metalloproteinase9 (MMP9) and their inhibitors, tissue inhibitor of metalloproteinase TIMP1 and TIMP2, in human colorectal cancer and their clinical significance. Methods The expressions of MMP2, MMP9, TIMP1 and TIMP2 in 30 primary colorectal tumors and adjacent noncancerous tissues were detected by immunohistochemical SP method. Results The positive rates of MMP2, MMP9 and TIMP1 in colorectal cancer were significantly higher than those in adjacent noncancerous tissues (P<0.05), and were closely associated with tumor differentiation, Dukes stages, progression of invasion depth and lymph node metastasis (P<0.05). The positive rate of TIMP2 was much lower in colorectal tissues than in adjacent noncancerous tissues (P<0.05), and was negatively correlated with Dukes stages, progression of invasion depth and lymph node metastasis (P<0.05), but not to tumor differentiation (P>0.05). A close correlation was present between MMP9 and TIMP1 expression (r=0.4924, P<0.05). Conclusion Overexpressions of MMP2, MMP9 and TIMP1 are obviously correlated with both invasion and metastasis of colorectal cancer, combined detection of which may be helpful in determining the biological behavior and prognosis of colorectal cancer.

　　KEY WORDS: colorectal cancer; matrix metalloproteinase; tissue inhibitor of metalloproteinase; immunohistochemistry

　　组织的浸润与转移是恶性肿瘤细胞的基本生物学特征之一[1]，有80%以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制剂——组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)共同维持细胞迁移和细胞外基质重建的动态平衡，其平衡失控是导致肿瘤细胞侵袭、转移的关键性事件[2]。本研究采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(streptavidin

　　perioxidase, SP)法检测MMPs和TIMPs在大肠腺癌组织及癌旁正常组织中的表达,探讨其在大肠癌的发生、发展、侵袭和转移中的作用,以期为评估预后和治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 标本选自西安交通大学医学院第一附属医院2007年9月～2007年12月间手术切除后经病理证实的30例原发性大肠腺癌患者。其中男性20例，女性10例;年龄33～80岁，平均54.3岁;结肠癌20例，直肠癌10例;高中分化癌26例，低未分化癌4例;有淋巴结转移者16例，无淋巴结转移者14例。Dukes分期：A期+B期14例，C期+D期16例。同时取正常结、直肠组织30例(正常手术切缘组织，正常切缘距肿瘤边缘至少10cm)进行染色对照。

　　1.2 主要试剂 兔MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2抗人多克隆抗体及通用型SP免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 方法 采用免疫组化SP法。用已知阳性的乳腺癌组织切片作阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.4 结果判断 MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的阳性显色均为细胞质出现棕黄色颗粒。根据阳性目标积分吸光度值，将免疫组化染色程度分为，(-)：吸光度值≤5;(+)：5<吸光度值≤10;()：10<吸光度值≤15;()：吸光度值>15。(-)为阴性表达;(+/)为弱阳性表达;()为强阳性表达。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件进行χ2检验、Fisher确切概率法检验及Spearman等级相关分析。以 P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2在大肠腺癌组织和正常切缘组织中的表达 MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2阳性染色为细胞质和(或)细胞膜出现棕黄色颗粒,主要表达于肿瘤细胞和(或)瘤旁的正常间质(图1、图2)。大肠癌组织中MMP2、MMP9、TIMP1表达的阳性率分别为100%(30/30)、100%(30/30)、73.3%(22/30)，明显高于癌旁正常组织的73.3%(22/30)、76.7%(23/30)、40%(12/30)，差异有统计学意义(P<0.05);并且MMP2和MMP9阳性表达的增强较TIMP1更明显。TIMP2在肿瘤组织中的阳性表达率为46.7%(14/30)，显著低于正常切缘组织中的80%(24/30)，经χ2检验差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2的表达与临床病理特征的关系 TIMP1、MMP2、MMP9表达强度与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期以及淋巴结转移呈正相关(P<0.05);与之相反的是TIMP2在大肠癌组织中低表达，并且随着浸润深度加深、Dukes分期越晚以及伴有淋巴结转移，其阳性表达率越低(P<0.05)，但与肿瘤分化程度无明显相关性(P>0.05，表1)。

　　2.3 MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2表达的相互关系 Spearman等级相关分析表明，TIMP1与MMP9表达存在正相关性(r=0.4924，P<0.05)，其余指标表达之间均无明显相关性(表2)。

　　3 讨 论

　　MMPs是一类具有Zn2+依赖性的高度保守的内源性蛋白水解酶，几乎能降解除多糖外的细胞外基质的所有成分。TIMPs则是一组内在特异性抑制MMPs活性的多功能因子。TIMPs与MMPs之间相互作用决定着细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)稳态的平衡,影响着肿瘤细胞的迁移和黏附，在组织浸润与转移中具有重要的意义[3]。表1 MMP2,MMP9,TIMP1,TIMP2的表达与大肠腺癌临床病理的关系

　　Tab.1 Relationship between clinicopathological characters and expression of MMP2/MMP9 and TIMP1/TIMP2 in colorectal cancer

　　FactorMMP2+/P〖4〗MMP9+/P〖6〗TIMP1-+/P〖8〗TIMP2-+PDifferentiation Wellmoderately differentiated206<0.05188<0.058144<0.051412>0.05 Lowlypoorly differentiated040400422Depth of invasion Muscular layer40<0.0540<0.05220<0.0504<0.05 Serous layer1610141261281610Lymph node metastasis Positive88<0.05412<0.05448<0.05142<0.05 Negative1221404100212Dukes stage A+B122<0.05140<0.054100<0.05212<0.05 C+D88412448142　表2 MMP2,MMP9,TIMP1,TIMP2表达之间的相互关系

　　目前认为肿瘤侵袭和转移起始于MMPs降解，破坏肿瘤组织周围的ECM和基底膜;随后，瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织迁移、黏附。Ⅳ型胶原和层黏连蛋白等是构成ECM和基底膜的主要结构蛋白，而MMPs之一的明胶酶(MMP2、MMP9)则是降解Ⅳ型胶原三螺旋结构的主要酶系,因而在肿瘤的侵袭转移中有重要起始意义[45]。临床研究亦表明，MMP2、MMP9以及特异抑制蛋白TIMP2、TIMP1表达异常多与肿瘤进展密切相关[67]。

　　本研究结果表明，大肠腺癌组织中MMP2、MMP9的表达阳性率(100%)明显高于正常切缘组织(P<0.05)，提示MMP2、MMP9在肿瘤原位生长中的促进作用。本组结果与同类文献相比较高[8]，可能与实验例数较少以及实验方法差异有关。MMP2、MMP9的阳性表达强度与大肠癌的分化及局部浸润程度、淋巴结转移与否以及Dukes分期呈正相关(P<0.05)，这些特征表现与MMP2、MMP9对于肿瘤侵袭激励机制密切相关[9]。本组结果提示我们，MMP2、MMP9表达增强提高了大肠癌的侵袭、转移能力以及随之而来的不良预后。在实验中我们也观察到MMP9表达较强的部位位于癌巢的周边区域及侵袭最活跃的位置，这与BODEY等[10]观察到的结果相同。提示MMP9在肿瘤侵袭方向上表达较高，应考虑为肿瘤细胞侵袭转移的正性调控因素。

　　TIMPs是MMPs的特异性天然抑制剂，这其中TIMP1主要结合抑制活化的MMP9和MMP3;TIMP2则与活化的或无活性的MMP2结合，终止MMP2的活性。

　　本组实验中TIMP1在大肠腺癌组织中有较高表达，其与浸润深度、Dukes分期、病理分级以及淋巴结转移呈正相关，且差异有统计学意义(P<0.05)。这与ISHIDA等[11]研究结果近似。也有研究认为TIMP1 mRNA水平可作为结直肠癌患者预后的指标[12]。提示TIMP1表达的增高预示着肿瘤更具侵袭力以及更差的预后。TIMP1的高表达可能反映了宿主控制MMPs活性提高的反馈性调节，其目的保护ECM完整性以对抗肿瘤的侵袭;但其升高程度小于MMPs的升高程度，使得MMPs的活性无法完全被TIMP1所抑制，两者失平衡以致肿瘤侵袭和转移的发生。CURRAN等[13]认为TIMPs与MMPs之间的平衡与细胞外基质降解的关系可能更为密切。我们的实验也观察到TIMP1(73.3%)和MMP9(100%)在大肠腺癌组织中不均衡的表达，且两者的表达具有相关性(r=0.4924，P<0.05)，MMP9阳性表达增强较TIMP1更明显。也有研究表明TIMP1是血清生长因子活性的重要组成成分，在肿瘤早期其蛋白表达增高并具有刺激肿瘤生长的作用，而在肿瘤晚期阶段则起到抑制作用[14]。这可能也是TIMP1表达增高的原因之一，提示TIMP1在肿瘤调控中的复杂性。

　　TIMP2是体内MMP2的特异性高效抑制剂，在肿瘤的侵袭和转移过程中起抗侵袭和抗转移作用[15]。本组实验中TIMP2在癌组织中的表达明显低于正常切缘组织，且与浸润深度、Dukes分期以及淋巴结转移呈负相关(P<0.05);但与组织分化程度无关联(P>0.05)。提示在大肠腺癌中MMP2与TIMP2间表达失衡致使ECM的降解，是启动肿瘤细胞迁移及黏附等恶性行为的关键因素之一。大肠腺癌晚期TIMP2表达也可能升高，这与ECM降解加速、MMP2活化增强导致其反应性的提升相关。这种TIMP2表达的升高可能预示着一种不良预后[16]。TIMP2阳性表达高低与预后和侵袭能力的关系仍需更多文献研究。

　　综上所述，本研究结果表明MMP2、MMP9、TIMP1的过度表达与大肠腺癌的侵袭、转移以及临床病理进展有密切关系，其联合检测有助于评估大肠腺癌的恶性生物学行为及预后。TIMP1、2与MMP9、2间表达失衡是大肠腺癌侵袭、转移的始动原因之一，选择性地提高TIMPs表达可作为MMPs生物治疗之新的靶点，值得更深入地研究。

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