编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP
发表时间：2010-06-18 浏览次数：1095次
作者：段小艺，王健生，郭佑民，刘敏，周斌，王全颖，杨广笑 (1. 西安交通大学医学院第一附属医院核医学科，陕西西安 710061; 2. 西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科，陕西西安 710061; 3. 西安交通大学医学院第二附属医院影像中心，陕西西安 710004; 4. 西安华广生物工程公司，陕西西安 710025)
摘要：目的 克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP3表位的cDNA片段，为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法 根据PEP3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物，正负引物互为模板进行PCR扩增，制备出两端含酶切位点的PEP3 cDNA片段，再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEMT Easy构建重组质粒pGEMT Easy/PEP3。结果 经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实，编码PEP3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEMT Easy中。结论 成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP3表位的cDNA片段。
关键词：表皮生长因子受体Ⅲ型突变体;PEP3表位;cDNA;基因克隆
Clone of cDNA encoding PEP3 epitope of epidermal growth factor receptor type Ⅲ mutantDuan Xiaoyi, Wang Jiansheng, Guo Youmin, Liu Min,Zhou Bin, Wang Quanying, Yang Guangxiao
(1. Department of Nuclear Medicine;
2. Department of Oncosurgery, First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;
3. Image Centre, SecondAffiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;
4. Xian Huaguang Biological Engineering Company, Xian 710025, China)
ABSTRACT: Objective Through cloning the cDNA fragment encoding PEP3 epitope of epidermal growth factor receptor type Ⅲ mutant(EGFRvⅢ) to establish the base for immunotherapy of carcinoma with high EGFRvⅢ expressing. Methods Designing the primer according to the base sequence of PEP3, cDNA was synthesized and amplificated by PCR. Then, the PCR product was subcloned into vector pGEMT Easy so as to construct recombinant plasmid pGEMT Easy/ PEP3. Results Zymocutting restriction enzyme identification and DNA sequencing conformed that cDNA encoding PEP3 was amplified and subcoloned into pGEMT Easy successfully. Conclusion cDNA encoding PEP3 epitope of EGFRvⅢ was coloned successfully.
KEY WORDS: epidermal growth factor receptor type Ⅲ mutant; PEP3 epitope; cDNA; clone
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)自分泌途径是恶性肿瘤发生发展的重要影响因素，其介导的信号传导对正常细胞和肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡均发挥重要调节作用。EGFRⅢ型突变体(EGFRvⅢ)是EGFR最常见的突变类型，在很多恶性肿瘤中呈现高表达，与肿瘤的发生、发展、恶性变和转移有密切关系。EGFRvⅢ仅存在于恶性肿瘤组织，正常组织不表达，因此成为肿瘤治疗的理想靶点。近年来，EGFRvⅢ在恶性肿瘤的基础和临床研究中日益受到重视，特别是在肿瘤的生物治疗中显示出了巨大的临床潜力。本研究通过PCR扩增出编码EGFRvⅢ突变区的13肽(PEP3)的cDNA片段，并与载体pGEMT Easy相连接，构建出pGEMT Easy/PEP3重组质粒，为高表达EGFRvⅢ肿瘤免疫治疗的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒、工具酶及试剂 质粒pGEMT Easy、大肠杆菌DH5α均来自西安华广生物工程公司;限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq聚合酶均购自华美生物公司和上海生工生物工程有限公司;主要试剂为国产或进口分析纯。
1.2 引物的设计和合成 通过GenBank查出EGFR和EGFRvⅢ基因全序列，根据EGFRvⅢ包含突变区13肽(PEP3，LeuGluGluLysLysGlyAsnTyrValValThrAspHis)氨基酸所对应的碱基序列，设计出一对引物，正向引物：5′CCTCGAGCTGGAGGAGAAGAAAGGTAATTAT
GTG3′，含有XhoⅠ酶切位点(CTCGAG);负向引物：5′CGGATCCGTGATCTGTCACCACATAATTACC3′，含有BamHⅠ酶切位点(GGATCC)。正反向引物间有12对互补碱基，由北京赛百盛基因技术有限公司负责合成，HPLC纯化。
1.3 目的基因的扩增和纯化 以正、负向引物互为模板进行PCR扩增。PCR反应过程如下：94℃预变性5min，40℃退火1min，72℃延伸70s，循环30次，72℃延伸5min。经酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，700mL/L乙醇洗涤沉淀后用10μL TE充分溶解沉淀。取1μL PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，并对产物进行定量。
1.4 重组质粒pGEMT Easy/PEP3的构建与鉴定 取上述PCR产物400ng(0.2μg /μL)、质粒pGEMT Easy 25ng(50ng/μL)、T4DNA连接酶5U(5U/μL)、10×T4DNA连接酶缓冲液1μL以及去离子水5μL(总体积10μL)建立连接反应体系，14℃连接16h。取50μL连接产物转化0.1mL感受态大肠杆菌DH5α，从LB平皿(Amp+)中挑取单菌落用碱裂解法小提质粒，经BamHⅠ酶切，筛选出正确重组质粒进行大量制备。对含有目的基因片段的重组质粒进行DNA测序(上海基康生物技术有限公司)。
2 结 果
2.1 目的基因片段的扩增与鉴定 根据GenBank中EGFRvⅢ cDNA序列设计出针对PEP3的两条引物，经PCR扩增后，用10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果显示在约50bp处可见一条扩增条带，此片段长度与预期值相符(图1)。图1 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(略)
2.2 重组质粒pGEMT Easy/PEP3的鉴定 经PCR扩增获得的PEP3 cDNA片段与载体pGEMT easy连接产生的重组质粒用BamHⅠ酶切后质粒被线性化，10g/L琼脂糖凝胶电泳可见一约3050bp的明显条带，证明PEP3 cDNA片段已经重组于pGEMT Easy上(图2)。
2.3 重组质粒DNA序列分析 以pGEMT Easy通用引物对获得的重组质粒进行DNA序列测定，测定的结果表明插入的PEP3 cDNA片段与设计的XhoⅠPEP3BamHⅠ片段序列完全一致，无碱基突变和读码框移位(图3)。图3 重组质粒pGEMT Easy/PEP3 DNA测序结果(略)
3 讨 论
许多恶性肿瘤均呈现EGFR过表达，以EGFR作为靶点的肿瘤治疗已经取得了令人瞩目的进展，但EGFR在人体许多正常组织亦有表达，使其应用受到限制。EGFRvIII是EGFR配体结合区缺失的突变体，它可在没有配体结合的情况下组成性激活酪氨酸激酶，诱发下游的信号转导途径，引起细胞异常增殖并抑制凋亡。由于EGFRvIII仅高表达于恶性肿瘤组织，正常组织中检测不到，因此以EGFRvⅡ作为靶点为高表达EGFRvIII肿瘤的特异性免疫治疗提供了新的线索。Achim等发现，针对EGFRvⅢ的单克隆抗体MAb806能选择性作用于表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞，而对表达野生型EGFR的细胞不起作用。EGFRvⅢ特异性抗体在体内能有效诱导机体产生CD+8 T淋巴细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，对抗体进行适当修饰(如连接毒素、脂质体、病毒或放射性核素)可增强对肿瘤细胞的杀伤效应。
肿瘤疫苗是一种很有发展前途的肿瘤免疫治疗措施。目前国内外针对EGFRvⅢ的疫苗以合成肽为主，其中对PEP3的研究最多。PEP3包含了EGFRvIII突变融合区，具有很强的特异性，它通过与MHCⅠ类分子结合，激活特异性T细胞，诱导CTL发挥主动抗瘤效应。为了克服短肽免疫原性弱，在体内易降解的缺点，人们对PEP3进行了各种免疫修饰或添加免疫佐剂，增强了其免疫原性和在体内的稳定性。
然而，人工合成肽对技术设备要求很高，费用昂贵，难以普及使用。而通过基因工程技术使外源基因在大肠杆菌中表达目的基因具有表达量高、操作简单、费用低廉、适合工业化生产等优点，并且可通过基因工程技术对目的基因进行修饰和改进。本研究根据已知的PEP3基因序列合成两条3′端部分碱基互补的长链引物，再以两条引物互为模板进行延伸，使之成为完整的双链DNA。这种方法相对传统的PCR法操作更简单、费用也低，并且可以保证延伸互补的准确性。制备出的PCR产物通过T4连接酶与线性载体连接，构建了重组质粒pGEMT Easy/EGFRvⅢ，鉴定和DNA测序与理论结果一致，为下一步构建表达质粒并进行大肠杆菌原核表达奠定了基础。
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