survivin与肿瘤放射抵抗的研究进展

　　作者：毕宏，孙宁 作者单位：广东医学院病理学教研室，广东湛江 524023

　　【关键词】 survivin 凋亡抑制蛋白/IAPs 肿瘤 放射抵抗 综述文献

　　放射治疗作为肿瘤治疗的重要手段之一，其目的主要是稳定和(或)治愈肿瘤，但在治疗剂量范围内仍然有肿瘤的放射抵抗和正常组织的放射损伤，因此大量的辅助方法应用于放疗以提高肿瘤的放射敏感性。随着分子生物学的发展，一些与肿瘤放疗抵抗相关的基因被鉴定出来，使人们能够通过各种手段作用于这些新的靶点以提高肿瘤的放射敏感性。IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)作为一组内源性细胞凋亡抑制蛋白在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色。survivin是IAPs家族的成员之一，主要作用是调控细胞凋亡和细胞分裂。由于它在肿瘤组织中特异性表达使其成为肿瘤放疗和化疗的新靶点。本文就survivin 的生物学特性，与放疗的关系及以之为靶点的放射增敏治疗综述如下。

　　1 survivin 的生物学特性

　　1.1 survivin的结构

　　IAPs是一类结构相关的细胞凋亡抑制蛋白，目前发现8个成员，分别为NAIP、cIAP1、cIAP2、XIAP、TsXIAP、MLIAP、apollon和survivin。IAPs家族成员一般含有2～3个杆状病毒重复区域(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat,BIR)结构域和羧基末端的环指结构，其中BIR功能区是发挥抗凋亡作用的主要结构。survivin是IAPs家族中分子量最小但抗凋亡能力最强而倍受关注的明星分子，由美国耶鲁大学的Altieri等[1]在1997年利用效应细胞蛋白酶受体1 (effector cell protease receptor1，EPR1)的cDNA在人类基因组的杂交筛选中分离并克隆出来，与EPR1同位于染色体17q25，全长15　kb，含4个外显子，3个内含子，编码分子量为16.5　kD的蛋白质。X光衍射晶体结构分析表明：survivin蛋白是同源二聚体，每个单体分子羧基末端缺乏环指结构，取而代之的是一个由40个氨基酸组成的α螺旋结构，此结构域可以加强与微管结构的相互作用;在氨基端只含有一个包含保守的Cys/His 的BIR功能区，BIR结构域对抑制凋亡的功能是至关重要的。

　　1.2 survivin的组织分布与调控

　　目前的研究显示，survivin在人类胚胎和胎儿器官中大量表达，除正常成人胸腺、CD34+骨髓干细胞、结肠上皮的基底细胞有少量表达外在绝大多数分化成熟的正常组织中没有表达。然而，在大多数被研究的肿瘤组织中过表达[2]。survivin在正常分化成熟的组织和肿瘤组织中差异表达的机制目前尚未明了。大量证据表明，很多致瘤因素参与了肿瘤中survivin的表达上调。野生型p53转染能下调survivin的表达，过表达survivin能抵抗阿霉素引起的p53依赖凋亡途径[3]。在原发淋巴瘤(PEL)和星型细胞瘤中，抑制信号转导与转录激活子(STAT3)能减少survivin的表达而介导凋亡[4]。另外，通过cHRas癌蛋白上调survivin的表达不依赖细胞周期进展和细胞增殖[5]，且PI3K和MEK1阻滞剂能引起survivin的减少，提示细胞内的Ras途径能调节survivin的表达。

　　2 survivin与肿瘤放疗抵抗的关系及其机制

　　2.1 survivin与肿瘤放疗抵抗的关系

　　大量研究表明，多数恶性肿瘤，特别是放射抵抗的细胞株均可检测到survivin的表达上调。Yoshida等[6]对宫颈癌进行研究后发现survivin在腺癌中的表达明显高于鳞癌，对这两种类型的肿瘤进行放射处理后发现腺癌的放射抵抗性也强于鳞癌。Asanuma 等[7]对5个不同放射敏感性的胰腺癌细胞系进行研究后发现，对X线辐射抵抗最强的PANC1细胞株中survivin的mRNA水平最高，说明检测照射前的survivin mRNA 水平可以预测其放射敏感性;对PANC1和辐射最敏感的MIAPaCa2给予亚致死剂量照射后，survivin mRNA 的表达水平都有显著的升高，伴随caspase3的活性显著下降，与致死剂量照射后存活细胞中的表达相一致。这一结果说明，survivin 参与了细胞固有的和放射诱导的放射耐受机制，抑制survivin的mRNA表达可能会提高胰腺癌对辐射的敏感性。

　　2.2 survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制

　　放射治疗作为肿瘤治疗的重要手段之一，其作用方式主要是通过损伤细胞的DNA，影响细胞的增殖状态，改变细胞周期的运行，最终引起肿瘤细胞的增殖性死亡或凋亡[8]。survivin可能正是在这些方面发挥作用从而导致肿瘤细胞的放疗抵抗。

　　2.2.1 survivin与放射引起的肿瘤细胞DNA损伤

　　射线引起的DNA损伤可以激活野生型p53基因，使细胞周期阻滞在G1期，对损伤进行修复后继续进入细胞周期循环，若修复失败则介导细胞的凋亡，放射敏感性与放射时DNA损伤程度及修复动力学相关。Chakravarti等[9]用包含显性负性survivin结构的腺病毒pAdS(T34A) 使survivin失活;同时用包含野生型survivin结构的pAdS(WT)转染恶性胶质瘤细胞，使其过表达，照射后用彗星试验检测到survivin低表达的细胞对DNA损伤的修复能力下降，对射线的敏感性增加。提示survivin通过对DNA双链损伤后修复的调节在恶性胶质瘤的放射抵抗中起主要作用。

　　2.2.2 survivin与放射引起的细胞周期改变

　　细胞周期的调控是放射敏感性的又一决定因子。大量体外试验表明，在分裂周期中不同时相的细胞对放射杀灭的敏感性不一，对放射最敏感的是M期细胞，其次为G2期，G1早期细胞相对敏感而后期则相对抵抗，S期细胞对放射的抵抗作用最强。Hunakova等[10]对卵巢癌细胞株(包括放射敏感株CH1和抵抗株SKOV3)进行放射处理，6　h后两个细胞株都发生了G2/M期阻滞，但24 h后只有CH1仍阻滞在G2/M期。然而也有学者认为G2期阻滞与放射敏感性无关，McIlwrath等[11]对12个放射敏感性不同的肿瘤细胞株进行照射，发现在放射诱导的G1期停滞与放射抵抗性高度负相关，缺乏G1期停滞的细胞株有更高的放射抵抗性。作为一个典型的有丝分裂基因，survivin对于有丝分裂和细胞分裂的正确执行是必不可少的[12]。survivin的活性依赖于其Thr34的磷酸化，细胞周期素依赖性激酶p34cdc2-cyclinB1是唯一一个能使survivin Thr34磷酸化并与有丝分裂装置结合的酶。纺锤体检测点的激活能够上调p34cdc2激酶的表达，并引起survivin表达的增加。有丝分裂时，激活的survivin借助其羧基末端α螺旋结构与有丝分裂纺锤体的微管蛋白结合，特异性地表达于G2/M期。Li等[13]用细胞分裂阻断剂将Hela细胞阻断在细胞周期的不同时期，发现G1期不能检测到survivin mRNA的表达，在S期表达上调6倍，在G2/M期表达上调40倍，说明survivin的表达与细胞增殖密切相关。Kappler等[14]在5个肉瘤细胞株中进行的研究表明，用survivin特异性的siRNA抑制survivin表达后，与对照组相比，G2/M期细胞数目增多，有丝分裂受损，多倍体细胞数目增加。 Rodel等[15]研究survivin在结肠直肠癌中的表达与其放射抵抗的关系，发现siRNA转染可降低survivin表达，在转染24h后引起各期细胞比例重新分布，G2/M期阻滞增加，caspase介导的凋亡也明显增加，这样，细胞被阻滞在一个对放疗更加敏感的时期。

　　2.2.3 survivin与放射引起的肿瘤细胞凋亡

　　放射治疗的主要机制之一是诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡率与放射治疗效率呈正相关。体外和体内实验[16]显示辐射可诱发多数肿瘤细胞凋亡，增加凋亡指数(AI)，但有的即使给予较高辐射剂量也不会发生凋亡。而且放射敏感性在不同类型的肿瘤细胞之间以及同种类型的不同分化细胞之间有所不同。Dubray等[17]研究非霍奇金淋巴瘤自发性凋亡、放射诱导性凋亡及放射疗效的关系，发现自发性凋亡水平是放疗反应的预测因子，自发性凋亡与放射诱导的凋亡水平呈正相关。以下三组实验证据支持survivin抑制凋亡的作用：首先，用重组体在细胞培养系统中使survivin表达能抑制细胞内部和外部的凋亡通路;其次，在p53缺失的小鼠上进行的体内实验发现，转基因表达的survivin能减少紫外线B引起的凋亡;再次，survivin分子的对抗物，包括反义寡核苷酸或显性负性突变体均可引起体外和肿瘤动物模型中自发的caspase 依赖性凋亡。研究表明，survivin的表达与自发和辐射诱导的凋亡水平以及辐射敏感性呈负相关。Grossman等[18]研究发现K14survivin转基因小鼠在角化细胞中持续表达survivin，这并不影响皮肤的分化和角化细胞的增殖，但与对照组相比，UVB照射后，survivin表达组的凋亡率下降了60%。转基因的细胞对于Fas介导的凋亡更加敏感，说明survivin提供的细胞保护对Fas凋亡途径无效。Rodel等[19]观察三种固有放射敏感性不同的结肠直肠癌细胞株(放射低度敏感的SW480、中度敏感的HCT15、高度敏感的SW48)中survivin表达对肿瘤细胞凋亡水平的影响：用2Gy和8Gy剂量照射后，集落形成试验结果显示，SW48细胞株的自发和辐射诱导的凋亡水平均高于SW480细胞株;Western blot和RTPCR结果显示，survivin在SW480细胞株中的自发和辐射诱导表达均高于SW48细胞株，HCT15则居中。survivin的表达水平与自发和辐射诱导的凋亡水平成反比，说明自发凋亡水平可以作为体内直肠癌对放射治疗的反应指标，survivin是结肠直肠癌细胞株中重要的凋亡抑制因子，对survivin的mRNA和蛋白水平的测定可以预测结肠直肠癌对放化疗的敏感性。

　　3 以survivin为靶点的肿瘤放射增敏治疗

　　由于survivin在肿瘤组织的特异性表达及其与放射治疗的关系，不仅可以将其作为放射敏感性的预测因子，而且还可以设计各种方法抑制survivin的表达，提高放射治疗的疗效。目前，通过靶向survivin的核酶、反义寡核苷酸以及siRNA等技术沉默其表达已经取得了显著的放疗增敏效果。

　　3.1 survivin核酶

　　靶向性核酶主要通过碱基配对与survivin mRNA结合，并切割破坏其RNA，降低survivin的表达水平。Pennati等[20]用靶向survivin的锤头状核酶作用于两个过表达survivin的黑色素瘤细胞株JR8和M14，稳定转染后发现两株细胞内生性表达核酶，且显著降低了survivin的表达;γ射线照射后，与亲代细胞相比，表达核酶的细胞克隆形成率下降，caspase3活性提高，凋亡水平增加。说明通过核酶技术减少survivin的表达能提高黑色素瘤细胞对γ射线的敏感性。

　　3.2 survivin反义寡核苷酸

　　反义寡核苷酸技术作为一种新型治疗手段，可通过多种途径有效阻止靶mRNA的翻译，引起相应蛋白产物的减少。Cao等[21]在肺癌小鼠模型中瞬时转染survivin与XIAP的反义寡核苷酸显著下调它们的表达，结果发现反义治疗联合放疗组的移植瘤出现了超过15 d的生长延迟，然而单纯反义治疗组则没有出现;在32 d的研究时间内，反义治疗并没有引起小鼠的死亡或体重下降。说明通过反义技术抑制survivin或XIAP的表达联合放射治疗可以提高肿瘤的放疗控制率。Lu等[22]在非小细胞肺癌H460细胞株中，用脂质体转染survivin反义链和错配链，48　h后检测发现转染反义链的细胞株survivin的表达明显低于对照组，再以3Gy射线照射，通过MTT检测和克隆形成试验可以测得转染survivin反义链组细胞的生存能力仅是对照组的1/3～1/2，说明针对survivin的反义寡核苷酸抑制其表达可提高H460细胞株的放射敏感性。

　　3.3 干扰性小RNA(short interfering RNAs, siRNA)

　　RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致靶基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象，目前RNA干扰已成为一种新的放、化疗增敏途径。Rodel等[15]用survivin特异性siRNA干扰survivin在结肠癌放射高度抵抗细胞株SW480和中度抵抗细胞HCT15中的表达，转染后24～48　h内使survivin mRNA水平及蛋白水平下降到最小值，而且在此期间对细胞进行照射可提高凋亡细胞比例并同时增加caspase3和caspase7的活性。通过对比发现，这种增强放射诱导凋亡的反应在放射抵抗株SW480中更加显著。Kappler等[23]以survivin siRNA转染肉瘤细胞，发现survivin表达明显下降，且肿瘤细胞的放射敏感性随照射剂量的增加而增加。

　　3.4 针对survivin的磷酸化位点Thr34

　　用腺病毒转染显性负性突变体T34A能明显下调survivin的表达，增强肿瘤组织对放射的敏感性。Asanuma等[24]用腺病毒对放射敏感的胰腺癌细胞株MIAPaCa2转染野生型survivin基因，与对照组相比，其放射敏感性显著降低，且伴随caspase3活性的下降;与此相反，对放射抵抗的PANC1细胞株转染survivin的显性负性突变体能增强此细胞株的放射敏感性，而且辐射引起了caspase3活性的增强，提示survivin的功能被抑制后，胰腺癌细胞的放射敏感性增强。

　　4 结语

　　survivin是IAP家族中结构和功能独特的成员之一，由于它在肿瘤组织的特异性表达使其成为肿瘤的诊断和预后判断的依据，以survivin为靶点的辅助治疗可以作为肿瘤放射治疗的增敏手段。但survivin参与凋亡和放射抵抗的具体机制有待进一步明确。而以survivin为靶点的放射增敏疗法目前多停留在实验室观察阶段，如何应用于临床，还需进一步研究。另外，需要注意的是，survivin对少数正常组织的细胞分裂是必须的，因此，在以survivin为靶点制定放疗方案时，要对其分子生物学特性有完整的理解，尽可能在杀灭肿瘤组织的同时，把对正常组织的损伤降到最小。

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