胃癌组织中基质金属蛋白酶-9和整合素β3 mRNA表达的临床意义
发表时间：2010-05-11 浏览次数：552次
作者：杨月明 叶再元 赵仲生 王元宇 作者单位：312000 浙江省绍兴第二医院(杨月明) 310014 浙江省人民医院(叶再元 赵仲生 王元宇)
【摘要】 目的 研究基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和整合素β3(Integrin β3)mRNA在胃癌组织中的表达及与临床病理参数、肿瘤微血管密度、生存期的关系。 方法 应用原位杂交和免疫组化，检测105例胃癌组织中MMP-9、Integrinβ3 mRNA和CD34的表达。结果 MMP-9和Integrinβ3 mRNA 阳性表达率分别为58.10%和60.95%，其阳性表达与胃癌生长方式、浸润深度、脉管侵犯、淋巴结及远处转移均密切相关(P均<0.01); MMP-9、Integrin β3 mRNA 的阳性表达病例的平均血管数均高于阴性表达病例的平均血管数(P均<0.05);MVD值分别与MMP-9和Integrin β3 mRNA的表达水平呈正相关(P均<0.05); MMP-9和Integrinβ3 mRNA的阳性表达以及MVD值≥39.5病例的5年生存率显著低于阴性表达和MVD 值<39.5的病例;MMP-9和Integrin β3 mRNA表达存在显著相关性(P<0.05)。 结论 MMP-9、Integrinβ3可促进胃癌血管生成，并参与肿瘤浸润转移过程，可以作为反映胃癌生物学行为和判断预后的有效指标。
【关键词】 胃癌 基质金属蛋白酶-9 整合素β3 转移 预后
【Abstract】Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and integrin beta-3 mRNA in gastric carcinoma and to find the correlation between the expression rate of them and clinicopathologic index，microvessel density and survival time of gastric carcinoma patients. Methods In situate hybridization and immunohistochemical techniques were used to detect the gene expression of MMP-9, Integrin beta-3 and CD34 in 105 gastric carcinoma specimens. Results In situ hybridization revealed that positive expression rate of MMP-9 and Integrin beta-3 mRNA was 58.10% and 60.95%，respectively. There was a significant correlation between the expression of them and growth pattern , depth of tumor invasion，vessel invasion , lymph node and distant metastasis (P<0.01). Mean tumor MVD of patients with positive mRNA expression was significantly higher than those with negative mRNA expression(P<0.05). In addition, MVD value was positively correlated with the expression level of MMP-9 and Integrin beta-3 mRNA (P<0.05). The five year survival rate of patients with positive mRNA expression and mean MVD value≥39.5/mm2 were significantly lower than those of patients with negative mRNA expression and mean MVD value<39.5/mm2; The expression of MMP-9 was significantly corelated with the expression of integrin β3 (P<0.05). Conclusion The expression of MMP-9 and Integrin β3 can promote tumor angiogenesis and contributes to tumor invasion and metastasis in gastric carcinoma. The expression of them may serve as valuable indicators of biological behaviour and prognosis of gastric carcinoma.
【Key word】 Gastric carcinoma Matrix metalloproteinase-9 Integrin beta-3 metastasis prognosis
肿瘤的侵袭转移是一个非常复杂的多环节、多步骤的连续过程，需要突破细胞外基质和基底膜构成的多个结构屏障。在分子水平上，涉及黏附分子、蛋白降解酶、细胞生长因子及促血管生成因子等的调控。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和整合素β3(Integrin β3)都与肿瘤形成和侵袭转移密切相关。本文旨在观察MMP-9、Integrinβ3 mRNA在胃癌组织中的表达和与胃癌病理参数、血管生成等的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象
取1986年至1998年手术切除的胃癌标本105例(有5年以上对患者的随访资料)。其中男70例，女35例，年龄38～78岁(平均57.6岁);管状腺癌37例，乳头状腺癌17例，低分化腺癌34例，印戒细胞癌8例，黏液腺癌9例;高、中分化癌63例，低、未分化癌42例;T1 20例，T2 24例，T3 39例，T4 22例;脉管侵犯76例;腹膜转移24例，肝转移18例。
1.2 实验方法
将组织蜡块连续切成5μm切片，备染HE、原位杂交和免疫组化。地高辛标记探针(长度为29-30碱基对)及敏感加强型原位杂交试剂盒为武汉博士德公司产品，针对人MMP-9 mRNA序列和针对人Integrin β3 mRNA序列严格按说明书操作;免疫组化试剂CD34(鼠抗人)和SP试剂盒购自福州迈新公司，CD34工作浓度为1：100。原位杂交操作主要包括杂交前预处理、杂交、杂交后处理，DAB显色及复染后封片，阴性对照设定不加含探针的杂交液RNA酶(RNase)预处理的标本;免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)，主要包括石蜡切片、常规脱蜡至水、抗原修复、3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭、滴加一抗、二抗及链霉素、抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物、DAB显色、复染封片，用PBS代替一抗做阴性对照，用试剂盒中阳性片子做阳性对照。
1.3 结果判断
MMP-9 mRNA为细胞浆着色，呈棕黄色; Integrin β3 mRNA为细胞膜着色，呈棕黄色。在高倍镜下，每视野统计200个细胞数，根据阳性细胞占全部肿瘤细胞的百分比[1]，<10%或无阳性着色为阴性(-)，11%～50%为弱阳性(+)，50%～75%为阳性(++)，>75%间为强阳性(+++)。肿瘤组织内微血管密度(MVD)的计算，按赵仲生[2]方法阳性血管数，以CD34阳性血管数作为MVD，(x±s)表示。
1.4 统计学处理
采用SPSS11.0统计软件，计量资料采用t检验，计数资料用χ2检验和Fisher-exact检验;对非参数资料用Spearman等级相关进行分析;对生存数据采用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异性。
2 结果
2.1 MMP-9、Integrin β3 mRNA表达、MVD值与胃癌参数关系
见表1。胃癌中的MMP-9(图1)和Integrin β3 mRNA(图2)的阳性表达率分别为58.10%和60.95%(正常胃黏膜MMP-9 mRNA呈阴性，而Integrinβ3 mRNA阳性表达率30%)。血管内皮细胞CD34染色阳性，癌组织内及癌巢周围多量微血管呈棕黄色至棕褐色，深染，逗点状、小管状或条索状(图3、4)，在胃癌生长方式、浸润深度和有无血管浸润、淋巴结转移、远处转移方面，MVD值差异均有非常显著性(P<0.01)。表1 MMP-9和integrin β3 mRNA 与105例胃癌临床病理参数的关系(略)
2.2 MMP-9、Integrin β3 mRNA的表达与胃癌MVD关系
MMP-9、Integrin β3 mRNA表达阳性者MVD值[(43.75±13.41)个/0.72mm2和(41.02±8.55)个/0.72mm2]明显高于阴性表达者的(33.45±13.92)个/0.72mm2 和(25.26±11.25)个/0.72mm2，P值为 0.001和0.025。MMP-9和Integrinβ3的表达与MVD呈正相关性(rs=0.497,p=0.001; rs=0.316, p=0.001)。
2.3 MMP-9和 Integrin β3 mRNA及MVD值与生存期的关系
MMP-9和 Integrinβ3 mRNA阳性表达及MVD值≥39.5个/0.72mm2者5年生存率均显著低于阴性表达及MVD值<39.5个/0.72mm2者(P均<0.05)，见图5～7。
2.4 Integrin β3和MMP-9 mRNA 表达的关系
Integrin β3和MMP-9 mRNA 表达显著相关(rs=0.47, P<0.01)。
3 讨论
肿瘤细胞能分泌多种水解酶，使贴近肿瘤表面的有限区域的基质降解而形成癌细胞移动的通路，从而参与肿瘤的侵袭和转移，其中以MMP-9尤为重要。研究证实胃癌和间质中的炎细胞均产生MMP-9，能降解包括基底膜Ⅳ型胶原在内的细胞外多种成分，使癌细胞向深层间质浸润的同时也突破淋巴管和血管的基底膜而向血管浸润，最终发生浸润和转移，它还能促进肿瘤血管生成[3，4]。本研究结果，MMP-9 mRNA阳性表达者中，胃区域淋巴结转移、脉管浸润、侵犯浆膜及浆膜外和远处转移发生率显著高于阴性表达者，提示MMP-9有可能成为预测胃癌浸润转移的标记物。
Integrin是一组二价离子依赖性细胞表面糖蛋白，介导细胞之间及细胞外基质(ECM)之间的黏附反应。大多数Integrin受体与ECM的识别点作为三肽RGD(Arg-Gly-Asp)序列而发挥其介导黏附的作用。 肿瘤细胞与基底膜(BM)表面的Integrin受体及各种非Integrin受体相结合、吸附后肿瘤细胞即直接分泌降解酶类或诱导宿主细胞分泌酶类，局部降解基底膜和基质即意味着肿瘤的浸润和转移[5]。本资料显示，胃癌组织Integrin β3 mRNA的表达与胃癌侵袭性生长有关，提示胃癌细胞表达Integrin β3 mRNA者侵袭能力强，它不仅影响了肿瘤细胞与ECM间的黏附能力，而且有可能影响其信号传导机制，从而增强其侵袭转移的潜能。
Integrin可能与生长因子受体激活途径相整合，与PKC、Eph/R-Ras、Ras /Shc/MAPK、PI3-K(磷酸酰肌醇3激酶)和FAK(黏着斑激酶)等信号分子相互作用，调节细胞骨架和血管生成相关基因以及血管内皮Integrin受体的表达，影响内皮细胞和细胞外基质的相互作用，从而导致肿瘤血管形成。肿瘤细胞产生的MMP-9除降解基底膜外，还参与肿瘤的血管生成，是肿瘤血管生成的关键因素[6]。另一方面肿瘤细胞产生的Integrin β3还促进MMP-9降解细胞外基质[7]。本研究证明，当MMP-9和Integrin β3 mRNA呈阳性或强阳性表达时MVD显著升高，提示随着浸润深度的增加和淋巴结及远处转移的出现，胃癌各细胞亚群合成和分泌MMP-9和Integrin β3也增加，并构成一个网络系统促进肿瘤血管生成。MMP-和 Integrin β3 mRNA可能与诱导胃癌血管生成密切相关，而阳性表达可能是胃癌细胞获得高侵袭、高转移表型的分子基础，因而可作为胃癌浸润转移和预后的分子标记物。
本资料显示，MMP-9和Integrin β3 mRNA阳性和阴性患者的术后5年生存率和平均生存时间差异有显著性，提示它们的表达上调是预后不良的标志，与MMP-9和Integrin β3 mRNA阳性表达可以促进肿瘤细胞浸润、淋巴结转移和远处转移，并可增加MVD的结论相一致。
【参考文献】
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