大鼠胸主动脉球囊损伤对细胞凋亡及凋亡相关基因Fas、Bcl2表达的影响

　　作者：褚现明 作者单位：青岛大学医学院附属青岛市海慈医院心内科，青岛266033

　　【摘要】 探讨大鼠胸主动脉球囊损伤后细胞凋亡和凋亡相关基因表达的变化规律。方法 将30只400～500 g的雄性SD大鼠随机分为2组，手术组(n=24) 行球囊扩张损伤大鼠胸主动脉术;对照组(n=6)不行球囊损伤，作为正常对照。分别于术后2、7、14、28 d取胸主动脉应用HE染色、TUNEL法、免疫组化和计算机图像分析仪进行形态学、细胞凋亡、增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡基因Fas;抗凋亡基因Bcl2表达水平检测。 结果 对照组管壁处于非增殖状态;手术组球囊损伤后7 d形成新生内膜，血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活跃;14 d内膜明显增厚，但VSMC增殖已减弱;28 d内膜继续缓慢增厚，管腔明显狭窄。动脉损伤后Fas表达和TUNEL法测定的凋亡规律一致，两周内凋亡较明显，但细胞凋亡高峰时间(中膜7 d、内膜14 d)迟于增殖高峰(中膜2 d、内膜7 d)，两周后凋亡与增殖均明显下降。动脉损伤后抗凋亡基因Bcl2表达下调，在中膜和内膜分别在7 d、14 d达最低水平，后回升，与凋亡基因Fas表达呈明显负相关(r=-0.878, P<0.001)。结论 动脉球囊损伤后，平滑肌细胞的凋亡呈现规律性变化，可能在管腔狭窄的病理过程中具有重要作用。

　　【关键词】 血管平滑肌细胞,凋亡,大鼠,球囊损伤,再狭窄

　　Abstract：Objective To investigate the effect of balloon withdrawal injury on aortic cell apoptosis and Fas/Bcl2 gene expression in rats. Methods Thirty SD male rats were randomly divided into 2 groups: Group 1(n=24) received balloon induced endothelium denudation in the thoracic aorta and were respectively sacrificed at day 2, 7, 14, 28 after artery injury; Group 2(control group, n=6) received no injury procedure and were sacrificed 28 days after procedure. After the thoracic aorta were harvested, immunohistochemistry staining was performed to measure the protein expression of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) and Fas/Bcl2 gene. Vessel morphological measurements were also taken. Results In normal rat arteries, PCNA was not detected. After balloon injury, the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in media reached its peak at day 2 and then decreased quickly, while in neointima, VSMCs proliferated extremely at day 7 and then decreased. At day 28 after balloon injury, remarkable neointima and luminal narrowing were found. After balloon injury, the expression of Fas gene was accorded with the apoptosis rule measured by TUNEL method. The peak time of apoptosis (7d in media, 14 d in neointima) was posterior to the peak time of proliferation (2 d in media, 7 d in neointima). After 14 days the apoptosis and proliferation decreased quickly. After balloon injury, Bcl2 expression in media reached the lowest level at day 7 and then upregulated; while Bcl2 expression in neointima reached the lowest level at day 14. The expressions of Fas and Bcl2 were in a remarkable negative correlation(r=-0.878, P<0.001). Conclusions After artery balloon withdrawal injury，there was regular change of apoptosis, which maybe play an important role in the process of luminal narrowing.

　　Key words： Vascular smooth muscle cell; Apoptosis; Rats; Balloon injury; Restenosis

　　目前经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)已成为治疗冠心病积极有效的办法，在挽救冠心病患者生命及改善生存质量方面已得到充分肯定。但术后再狭窄大大影响了经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)及支架植入术后远期疗效，同时也是研究热点。研究表明，PTCA后损伤血管弹性回缩、新生内膜形成及负性重构(慢性缩窄)是再狭窄发生的主要机制,其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的过度增殖和迁移在血管内膜增厚、血管重构、管腔狭窄中的关键作用已有大量研究证实[1]。但血管损伤后细胞凋亡的变化规律及其在再狭窄过程中的意义有待进一步阐明。本实验旨在研究大鼠胸主动脉球囊损伤后细胞凋亡规律及其与细胞增殖的关系，为再狭窄的防治提供可能的途径和理论依据。

　　1 资料和方法

　　1.1 动物分组及处理

　　选用体重400～500 g的雄性SD大鼠30只(购于北医动物中心)。大鼠随机分为2组。 (1) 手术组(24只) 行球囊损伤大鼠胸主动脉术。按术后处死时间又分为2,7,14,28 d亚组，每组6只。(2) 对照组(6只) 不行球囊损伤，余操作同手术组，做假手术处理，为正常对照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠胸主动脉球囊损伤模型及标本制作 手术组参照文献[2]用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，经左侧颈总动脉插入2F球囊导管，仔细操作导管越过主动脉弓进入胸腹主动脉远端，即肾动脉分叉处。注入生理盐水0.15～0.2 ml回拉至主动脉弓颈总动脉开口处，重复6次并旋转方向以充分剥脱内皮, 损伤胸主动脉，之后取出导管，缝合伤口。为证实手术成功，另取3只大鼠，术后即刻从大鼠左颈静脉注入0.5% Evan’s蓝(3 ml/kg)，1 h后处死动物，观察内皮剥脱情况，并制作术后即刻主动脉HE切片，均证明主动脉内皮剥脱完全，管壁弹力层可见部分断裂。在不同处死时间，动物麻醉后开胸暴露主动脉，取横膈上1～2 cm处血管段，投入10%中性缓冲甲醛溶液中固定24 h，脱水，透明，石蜡包埋。

　　1.2.2 形态学观察 切片(4 μm)苏木精伊红(HE)染色,光学显微镜下观察内膜增生情况并用VIDAS图像分析仪(德国)测定动脉横截面中：管腔面积(luminal area，LA)，内膜面积(intima area，IA)，中膜面积(media area，MA)，内膜/中膜面积比(intima/media area ratio，IA/MA)，内、外弹力层包绕面积(internal or external elastic lamina area，IEL，EEL)，管腔面新生内皮覆盖百分率(覆盖率)。

　　1.2.3 凋亡细胞测定 用TUNEL凋亡试剂盒(北京中山)按说明操作，棕黄色为阳性，VIDAS图像分析仪(德国)测定阳性细胞数，并行细胞总数计数，用阳性细胞百分率表示。

　　1.2.4 细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡基因Fas、抗凋亡基因Bcl2测定 SP试剂盒购于北京中山生物技术公司，石蜡切片(3 μm)后，用SP法进行PCNA(北京中山)、凋亡基因Fas(Santa Cruz)、抗凋亡基因Bcl2(Santa Cruz)的免疫组化染色。黄至棕黄为阳性，PCNA定位于胞核，Fas定位于胞膜胞浆，Bcl2定位于胞浆。VIDAS图像分析仪(德国)随机测量每张切片6个视野中阳性细胞的百分率及平均光密度，取其均数，用两者乘积再乘以100作为阳性表达指数来表示PCNA、Fas、Bcl2的表达水平。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS11.0软件进行统计分析，采用t检验及相关分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠胸主动脉球囊损伤后血管形态学变化

　　对照组内膜由单层完整内皮细胞及少量细胞外基质组成。手术组术后2 d可见内弹力板模糊,多处断裂，管腔面毛糙无内皮细胞;新生内膜在术后7 d出现，14 d迅速增厚至数倍，可见大量增生的VSMC，排列紊乱，形态与中膜明显不同;28 d内膜继续缓慢增厚，管腔面积较对照组明显缩小(P<0.01);术后7 d可见到少量新生内皮细胞[覆盖率(15.24±2.34)%],28d单层新生内皮细胞几乎覆盖整个腔面(覆盖率>95%)(表1，图1)。

　　2.2 大鼠胸主动脉球囊损伤后管壁增殖指标PCNA表达的变化

　　对照组管壁PCNA偶见表达。手术组中膜在术后2 d明显表达PCNA，7 d表达迅速下降，且主要集中于内弹力板附近，14 d中膜表达恢复至对照组水平。而新生内膜在术后7 d出现，内膜全层强阳性表达PCNA;14 d新生内膜阳性表达有所下降，有向腔面聚集的趋势;术后28 d内膜仅少量表达。相邻时间点间比较P<0.05(表2)。表1 大鼠胸主动脉球囊损伤后新生内膜形成及血管重构的变化注:与对照组相比， aP<0.01表2 大鼠胸主动脉球囊损伤后凋亡及PCNA、Fas、Bcl2表达的变化注：各组内相邻时间点间比较均为P<0.05

　　2.3 大鼠胸主动脉球囊损伤后管壁平滑肌细胞凋亡规律

　　正常对照组几乎未发现TUNEL阳性着色细胞(TUNEL染色法)。手术组中膜在术后2 d可见棕黄色阳性凋亡细胞，占细胞总数(3.12±0.71)%，7 d为(8.021.78)%，后凋亡减弱。而新生内膜在术后7 d凋亡率为(4.78±1.14)%， 14 d内膜凋亡达高峰[(26.23±4.22)%]，28 d凋亡明显减弱[(5.02±1.19)%]。相邻时间点间比较P<0.05(表2)。

　　2.4 大鼠胸主动脉球囊损伤后增殖与凋亡的关系

　　对照组血管未见明显增殖与凋亡，损伤后中膜、新生内膜增殖高峰分别出现在术后2 d、7d，早于凋亡高峰7 d(中膜)、14 d(内膜)(表2)。

　　2.5 大鼠胸主动脉球囊损伤后凋亡基因Fas表达变化

　　正常对照组管壁偶见Fas阳性表达细胞。手术组中膜在术后2 d可见Fas表达， 7 d达高峰，后迅速下降。而新生内膜术后7 d 时Fas阳性指数为4.25，14 d内膜表达达高峰，28 d表达明显减弱。相邻时间点间比较P<0.05。Fas表达和TUNEL法测定的凋亡规律一致(表2)。

　　2.6 大鼠胸主动脉球囊损伤后抗凋亡基因Bcl2表达变化

　　正常对照组管壁大量表达Bcl2。手术组中膜在术后2 d阳性表达下降，7 d达最低水平，后回升，28 d表达趋于正常。而新生内膜术后7 d阳性表达明显， 14 d仅少量表达，而后表达增加， 28 d表达量趋于正常。相邻时间点间比较P<0.05(表2)。

　　2.7 大鼠胸主动脉球囊损伤后管壁凋亡基因Fas与抗凋亡基因Bcl2表达的关系

　　动脉球囊损伤后管壁凋亡基因Fas与抗凋亡基因Bcl2表达之间做相关分析，呈明显负相关(r=-0.878， P<0.001)。3 讨论

　　PCI术后再狭窄已证实是在原有冠脉粥样硬化病变基础上，机械扩张损伤后的过度损伤反应。其中VSMC过度激活、增殖和迁移以及细胞外基质的过度沉积起到关键作用，针对这些机制已作了大量研究，并部分应用于临床，但都没有从根本上解决再狭窄问题。动脉损伤后的调亡贯穿于损伤反应的全过程，阐明凋亡规律并进行适当干预可能对再狭窄的防治具有重要意义。

　　静止细胞处于非增殖状态;而在分裂因子刺激和血管损伤的情况下，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKIs)表达迅速下降，产生一种PRB磷酸化和细胞周期顺利进行的可容许状态[3]。PCNA是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，在DNA合成时促进DNA链的延长，是细胞进入并通过S期所必须的，在G1晚期和S期表达，可作为反映细胞增殖程度的可靠指标，其表达水平与细胞增殖程度成正比，表达越多表明增殖能力越强，反之亦然[4]。

　　血管系统细胞凋亡是细胞程序性死亡过程，受许多基因和细胞因子影响，如Fas、Bax、Bcl2、cmyc、TNF等。细胞凋亡的主要途径是 caspase途径，而caspase途径的上游启动程序为Fas与其配体FasL的结合，因此Fas被认为是重要的凋亡基因，其表达水平与凋亡程度成正比。细胞生存力在分子水平主要由基因家族介导凋亡和抗凋亡信号之间的平衡来控制，其中最主要的是Bcl2家族，Bcl2家族通过抑制细胞凋亡来延长细胞的存活时间，被认为是凋亡抑制基因[5,6]。

　　近年发现，在人类的心血管系统中亦存在细胞凋亡现象，且与许多心血管疾患的发生、发展密切相关，在脉管系统细胞凋亡由Fas/FasL信号介导。管壁细胞凋亡是血管重构的一个主要特点，对急慢性血管损伤后的血管重构起重要作用，尤其对血管机械性损伤后的再狭窄有重要的影响[7]。腺病毒编码FasL在球囊损伤的大鼠颈动脉局部释放，诱导增生的平滑肌细胞产生凋亡并有效抑制了新生内膜的增厚[8]。正常的血管内皮细胞可以抑制Fas介导的凋亡[9]。Bcl2蛋白家族在VSMC中的重要功能作用已通过急性剥脱实验证实，在血管狭窄处通过反义RNA技术去除BclXL可以诱导VSMC的凋亡，从而减轻新生内膜增厚[10]。

　　本实验中动脉球囊损伤后VSMC过度增殖、新生内膜过度增生、血管负性重构导致管腔狭窄, 相关研究已发现平滑肌细胞表型变化、P21、P27表达在此过程中具有重要意义[1113]。本实验进一步发现，正常动脉凋亡不明显，动脉球囊损后2周内凋亡明显增加，但细胞凋亡高峰时间(中膜7 d、内膜14 d)迟于增殖高峰(中膜2 d、内膜7 d)，2周后凋亡与增殖均明显下降; 动脉球囊损伤后抗凋亡基因Bcl2表达下调，与凋亡基因Fas表达呈明显负相关;另外动脉球囊损伤后28 d内皮修复基本完成，同时内膜增殖和凋亡趋于正常，提示内皮保护的重要意义。

　　正常血管细胞增殖与凋亡处于动态平衡，血管形态结构保持相对稳定。本实验揭示了动脉损伤后VSMC增殖和凋亡均发生明显规律性改变，提示凋亡与增殖的失衡在动脉损伤后管腔狭窄过程中扮演重要角色，这为再狭窄的防治提供了可能的研究方向和理论依据。

　　【参考文献】

　　[1]Grube E, Gerckens U, Buellesfeld L. Drug eluting stents: clinical experiences and perspectives[J]. Minerva Cardioangio, 2002,50:469 473.

　　[2]Lee CW, Park SJ, Park SW, et al. Alltransretinoic acid attenuates neointima formation with acceleration of reendothelialization in ballooninjured rat aorta[J]. J Korean Med Sci, 2000, 15: 3136.

　　[3]Wakino S, Kintscher U, Kim S, et al. Retinoids inhibit proliferation of human coronary smooth muscle cells by modulating cell cycle regulators[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2001, 21: 746751.

　　[4]Miniati DN, Hoyt EG, Feeley BT, et al. Ex vivo antisense oligonucleotides to proliferating cell nuclear antigen and Cdc2 kinase inhibit graft coronary artery disease [J]. Circulation, 2000, 102 (19 Suppl 3): Ⅲ 237242.

　　[5]Kockx MM,Herman AG.Apoptosis in atherosclerosis:benificial or dertrimental[J]. Cardiovasc Research, 2000, 45: 736746.

　　[6]Kockx MM, De Meyer GR, Muhring J, et al. Apoptosis and related proteins in different stages of human atherosclerotic plaques[J]. Circulation, 1998, 97: 23072315.

　　[7]Kim HS, Hwang KK, Seo JW, et al. Apoptosis and regulation of Bax and BclX proteins during human neonatal vascular remodeling[J].Arterioscler Thomb Vasc Biol, 2000, 20: 957963.

　　[8]Geng YJ, Henderson LE, Hevesque EB, et al. Fas is expressed in human atheroslerotic intima and promotes apoptosis of cytokineprimed human vascular smooth muscle cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997, 17: 22002208.

　　[9]Sata M, Suhara T, Walsh K. Vascular endothelial cells and smooth muscle cells differ in their expression of Fas and Fas ligand and in their sensitivity to Fas ligandinduced cell death: implications for vascular disease and therapy[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20: 309316.

　　[10]Pollman MJ, Hall ZL, Mann MJ, et al. Inhibition of neointiml cell bclx expression induces apoptosis and regression of vascular disease[J]. Nat Med, 1998, 4: 222227.

　　[11]董果雄,褚现明,张社华,等.全反式维甲酸对球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮后平滑肌细胞增殖和P21表达的影响[J].中国分子心脏病学杂志,2003,3:339343.

　　[12]褚现明,钟志欢,王国栋，等. 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉VSMC表型变化及增殖的影响[J].青岛大学医学院学报,2005,41:297301.

　　[13]褚现明,李 冰,杜日映, 等. P27对大鼠胸主动脉球囊损伤后管腔狭窄的作用[J]. 中国动脉硬化杂志, 2006,14: 417421.