外周血DNA和hTERT在肺癌诊断中的应用

　　作者：王京，吕可洁，朱广昌 作者单位：北京,首都医科大学附属北京友谊医院胸外科

　　【摘要】 目的 检测肺癌患者血清DNA含量及hTERT的表达水平，寻求微创、高敏感性及特异性的检测方法，为肺癌早期诊断提供新指标。 方法 41例病理证实肺癌患者，22例正常人设为对照组。磁珠悬浮法提取测定血清DNA含量;巢式PCR法扩增血清hTERT片段，测定灰度比。 结果 肺癌患者、正常人血清DNA含量均数分别为33.464和18.420，肺癌组血清DNA浓度显著高于正常对照组(P<0.01)。巢式PCR法扩增血清hTERT片段，测定灰度比作为诊断分界点，绘制ROC曲线，AZ=0.852，AZ的95%置信区间为CI(0.750，0.953，P=0.000)，因此可以认为血清hTERT对于肺癌的诊断具有中等准确性。诊断分界点=0.4时，其Kappa=0.477，(P<0.01)，有统计学意义，其与病理诊断的一致性较好。结论 外周血DNA和hTERT在肺癌诊断中具有较好的敏感性和特异性，可能成为肺癌早期诊断的新检测手段。

　　【关键词】 肺癌;DNA;hTERT;基因诊断

　　Application of Serum DNA and hTERT in Diagnose of Lung Cancer

　　WANG Jing, LV Kejie，ZHU Guangchang

　　Department of Throcic Surgery, Beijing Friendship Hospital Affiliated of the Capital University of Medicine Sciences，Beijing 100050,ChinaAbstract：Objective This study designed to assess a quantitative molecular assay of serum DNA and the expression of hTERT in patients with lung cancers to explore a novel noninvasive approach，elevating the sensitivity and specificity in diagnose of lung cancer. We conducted the clinical study to provide a new marker for earlier lung cancer detection. Methods Fortyone informed patients with lung cancers and 22 healthy persons were included as control. DNA was extracted from serum samples with MaGaZorb DNA MiniPrep Kit and quantificated , then hTERT sequences was amplified by nested PCR using gene primers. Results Mean concentration of serum DNA between patients with lung cancers and healthy persons was 33.464μg/ml and 18.420μg/ml respectively. Concentration of free circulation DNA in patients with lung cancers was higher than the other group (P<0.01). The area under the ROC curve by ratio of gray scale was 0.852 (95% CI, 0.750 to 0.953). Amplification of serum hTERT by nested PCR was a approach with moderate veracity to detect lung cancers. Meanwhile, it had a good coherence with pathology (Kappa=0.477,P<0.01). Conclusion The level of free circulating DNA in patients with lung cancers was higher than healthy persons. Amplification of serum hTERT by nested PCR was a approach with high sensitivity. So it may be a new, noninvasive approach for early detection of lung cancers.

　　Key words：Lung cancer;DNA;hTERT;Gene diagnosis

　　研究表明恶性肿瘤患者循环血中DNA水平不仅远远高于正常人,而且还具有肿瘤特征性的DNA改变,并和肿瘤组织中表达的同一基因一致[1]。端粒酶在永生化细胞系及恶性肿瘤衍生的细胞株中表达均为阳性，在正常细胞中不表达[2]。通过对肺癌患者外周血DNA的提取分析,巢式PCR法扩增血清hTERT(人类端粒酶逆转录酶)，研究其表达水平，将为肺癌的早期诊断提供重要线索,并将可能为肺癌的治疗、术后监测及预后的判断提供重要依据。为此,我们检测了肺癌患者外周血DNA水平及hTERT浓度,以探讨外周血DNA及hTERT浓度检测对肺癌的诊断价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　选择胸外科2005年经细胞学或病理学检查证实首次治疗的肺癌患者41例;其中腺癌19例,鳞癌15例，鳞腺癌2例，小细胞癌3例，大细胞癌2例;男性17例,女性24例;年龄18～75岁,平均年龄59岁;按世界卫生组织(WHO)肿瘤分期标准:Ⅰ期14例、Ⅱ期18例、Ⅲa期9例。并随机选择健康体检者22例进行对照。所有对象外周血白细胞、肝肾功能正常,无慢性肝炎和自身免疫系统疾病。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验试剂 (1)琼脂糖、TaqDNA聚合酶;(2)试剂盒：磁珠纯化DNA试剂盒(BSCOSS2)，北京佰亿新创科技有限公司;TaqPCR试剂盒(KT10101)，北京天为时代公司;DNA Marker1(MD10101)，北京天为时代公司;PCR引物，北京赛百盛基因技术有限公司;(3)PCR引物设计与合成：hTERT碱基序列定位于5p15.33，外重引物343bp(2 647～2 989)，内重引物326bp(2 662～2 989，GenBank assession number AF015950)，应用Primer3分析软件进行设计，北京赛百盛基因技术有限公司。

　　hTERTup(P1): 5′GCGTTTGGTGGATGATTTCT3′

　　hTERTdown(P2): 5′CAAGACCCCAAAGAGTTTGC3′

　　hTERTup(P3): 5′TTTCTTGTTGGTGACACCTC3′

　　hTERTdown(P4): 5′CAAGACCCCAAAGAGTTTGC3′

　　1.2.2 主要设备 DNA Thermal Cycler，美国Perkin Elmer Cetus公司;紫外凝胶成像仪Chemi Doc，意大利BioRAD;紫外可见分光光度计Ultrospec3100，英国Biochrom Ltd;台式低温离心机，上海安亭科学仪器厂;低温冰箱ULT13863V30，美国REVCO公司;电泳仪EPS300，上海天能科技有限公司。

　　1.2.3 实验方法 (1)血清DNA的提取及浓度测定。抽取实验对象3ml血标本置入红管离心处理(如不能及时处理，可存放4℃冰箱不超过6小时)——取离心后上层血清置入1.5ml离心管，-80℃保存;血清标本、MagaZorb DNA MiniPrep Kit 试剂室温化，取12μl PK(蛋白酶)置入1.5ml微量离心管，取120μl血清移至上管，并移入120μl Lysis Buffer，混匀15秒，56℃温浴10min;加300μl Binding Buffer 至上管，加入12μl混匀的MagaZorb试剂，充分混匀，室温温浴10min，将微量离心管放于磁力架上，吸附已结合DNA的磁珠，弃上清液备用;加600μl Wash Buffer 至上述微量离心管充分混匀后放于磁力架上，吸附磁珠，弃上清液，重复洗涤1次;加20μl Elution Buffer 至上述微量离心管充分混匀10min后放于磁力架上，吸附磁珠，仔细将上清液移入干净微量离心管，-20℃保存备用;2.5μl DNA 产物溶于500μl 去离子水中，稀释200倍，取90μl去离子水入比色皿作为对照，放入紫外可见光分光光度计比色架进行标准化;擦净比色皿，移入90μl稀释后的DNA产物，测定浓度并记录数值。每个样本测定3次，取中间值，DNA浓度(μg/ml)=测定DNA浓度/6;(2)巢式PCR扩增hTERT。第一次扩增，PCR扩增体系(25μl)：10×Reaction Buffer2.5μl;dNTP Mixture(2.5mmol/l each)2μl;Taq(2.5u/μl)0.35μl;GAPDHup(10μmol/l)1μl;GAPDHdown(10μmol/l)1μl;DNA产物2μl;ddH2O16.15μl

　　反应体系加石蜡油20μl。

　　反应条件：94℃预变性3min;94℃变性30s;52℃退火1min;72℃延伸1min;20个循环后72℃延伸10min

　　第一次扩增产物稀释100倍，取4μl用于第二次扩增。

　　第二次扩增，PCR扩增体系(25μl)：10×Reaction Buffer 2.5μl;dNTP Mixture(2.5mmol/l each)2μl;Taq(2.5u/μl) 0.3μl;GAPDHup(10μmol/l)1μl;GAPDHdown(10μmol/l)1μl;第一次扩增产物(1%)4μl;ddH2O14.2μl

　　反应体系加石蜡油20μl。反应条件：预变性、94℃、3min;变性、94℃、30s;退火、52℃、1min;延伸、72℃、1min;26个循环后72℃延伸10min

　　反应结束，取7μl PCR产物在1.25%的琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙啶)电泳，紫外灯观察，紫外凝胶成像仪扫描成像。每次均设阳性及阴性对照。成像照片应用图像分析处理系统进行灰度扫描，分析测定面积的积分光密度值。

　　1.3 统计学方法

　　结果经SPSS11.5统计分析软件进行分析处理，计量资料采用均数±标准差描述，单因素方差分析;计数资料采用构成比描述，卡方检验。建立ROC曲线(受试者工作特征曲线)，计算曲线下面积，两者一致性比较采用Kappa检验方法，P<0.01差异有统计学意义，0.010.05差异无统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 DNA含量测定

　　实验提取63例血清标本DNA(肺癌组41例，正常对照组22例)，紫外可见分光光度计测定浓度：肺癌组均数为33.463 7μg/ml，标准差为9.45118，95%CI(30.48，36.45)μg/ml，双侧检验P=0.333>0.05，本组数据近似正态分布。正常对照组均数为18.4200μg/ml，标准差为5.56294，95%CI(14.44，22.40)μg/ml，双侧检验P=0.999，本组数据近似正态分布。

　　两组数据经SPSS11.5统计分析软件进行单因素方差分析P<0.01，差异有统计学意义，由此可以认为肺癌组血清DNA含量显著高于正常对照组。

　　2.2 血清hTERT表达检测

　　首先通过管家基因GAPDH验证DNA质量，使用双重引物P1P2、P3P4 通过巢式PCR扩增hTERT，1.25%琼脂糖电泳后照相。实验中用提取肺癌组织DNA作阳性对照，ddH2O作阴性对照，对63例研究对象的血清DNA扩增后照片中条带进行灰度测定，并与相应管家基因GAPDH扩增得到的条带灰度值相比，得到hTERT灰度比值，见表1。表1 hTERT扩增后灰度比测定结果拆分为2×2表格，计算出FPR值(假阳性率)和TPR值(真阳性率—敏感度)构成一对，即为ROC工作点，见表2。表2 hTERT的ROC工作点 ROC曲线下面积AZ=0.852，AZ的95%置信区间为CI(0.750，0.953，P=0.000)，因此可以认为血清hTERT对于肺癌的诊断具有中等准确性。进一步取不同的灰度比值作为分界点，对其诊断敏感性、特异性进行分析，并计算其Kappa值。当诊断分界点为0.2时Se=82.93%，Sp=68.18%，Kappa=0.456;当诊断分界点为0.4时Se=75.61%，Sp=86.36%，Kappa=0.477;当诊断分界点为0.6时Se=65.85%，Sp=95.45%，Kappa=0.416;当诊断分界点为0.8时Se=56.10%，Sp=100%， Kappa=0.367

　　由上分析可见，诊断分界点=0.4时，其Kappa=0.477，敏感性Se=75.61%，特异性Sp=86.36%，阳性预测值PV+=31/33=93.94%，阴性预测值PV-=10/29=34.48%;敏感性、特异性较好，Kappa高于其他诊断分界点，当Kappa=0.477时P<0.01，差异有统计学意义，其与诊断金标准——病理诊断的一致性较好。所以利用巢式PCR扩增血清hTERT对肺癌有诊断价值。

　　3 讨论

　　在当今的医疗条件下，如何能够早期发现恶性肿瘤是提高其疗效的关键。理想的检测方法应该是取材无创或微创、方法简便能适应群体筛查、结果敏感特异性强。因此，外周血肿瘤相关指标的检测及研究成为热门。目前在肺癌检测中已广泛应用于临床的有CEA(癌胚抗原)、CYFRA211(细胞角蛋白片段)、NSE(神经原烯醇化酶)[3]。但是除NSE在小细胞肺癌的敏感度达到60%～80%外[4]，其余敏感度均在50%以下[5]。本实验得出：肺癌患者血清DNA浓度显著高于正常人群;肺癌患者血清hTERT显著高于正常人群，诊断分界点=0.4时，其与诊断金标准——病理诊断的一致性较好。外周血DNA和hTERT在肺癌诊断中具有临床应用价值，为肺癌的早期诊断及筛查提供了新的手段，其检测技术成熟，方法简单，易于掌握;受检者痛苦小，费用低，易于接受，且可批量检测用于群体筛查;与病理诊断具有较好的一致性。因此，该项指标具有较好的应用前景，值得进一步研究推广。

　　【参考文献】

　　[1] Sozzi G，Conte D，Leon M，et al.Quantification of Free Circulation DNA as a Ddiagnostic Marker in Lung Cancer [J]. Journal of Clinical Oncology，2003，21(21)：39023908.

　　[2] Oh S,Song YH,Yim J,et al. Identification of Mad as a repressor of the human telomerase (hTERT) gene [J]. Oncogene，2000，19(11)：14851490.

　　[3] 陆慰萱. 呼吸系统疾病诊断与诊断分析[M]. 上海：上海科学技术出版社，2004.443449.

　　[4] 张昕，张湘茹.肺癌肿瘤标志物的临床价值[J]. 癌症进展杂志，2005，3(3)：156162.

　　[5] Ando S，Kimura H，Iwai N，et al. Optimal combination of seven tumor markers in prediction of advanced stage at first examination of patients with nonsmall cell lung cancer [J]. Anticancer Research，2001，21(4)：3085