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《肿瘤学》

胃癌耐药基因检测对临床化疗的指导意义

发表时间:2010-04-23  浏览次数:377次

  作者:贾长河, 康 谊, 王文玉, 任 颖 作者单位:郑州,河南省人民医院消化科,2.肿瘤科,3.病理科

  【摘要】 目的 检测人体胃癌组织中耐药基因的表达情况,并根据检测结果选用相应的敏感药物化疗,探讨耐药基因检测对胃癌临床化疗的指导意义。方法 将80例经胃镜检查及病理证实为胃癌的患者,根据编号预先随机分为适配组和非适配组2组,每组40人。应用免疫组织化学方法检测所有病例胃癌组织中Pgp、GSTπ、TopoⅡ的表达情况。适配组患者根据检测结果选用相应的敏感药物适配化疗,非适配组统一选用FOLFOX4方案化疗。结果 Pgp、GSTπ、TopoⅡ表达率分别为51.5%、57.5%、46.3%;Pgp、Topo Ⅱ的表达与肿瘤分化程度有关,Pgp高中分化者表达率高于其他非高中分化者,Topo Ⅱ高中分化者表达率低于其他非高中分化者;GSTπ的表达与分化程度无关,高中分化者与非高中分化者无显著差异。适配组化疗有效率为57.5%,非适配组有效率为35%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Pgp、GSTπ、TopoⅡ的耐药机制各不相同,根据耐药基因的检测结果针对不同患者,实施科学的、药物适配的个体化化疗方案对胃癌治疗具有重要的指导意义,可以提高化疗效果。

  【关键词】 胃癌; P糖蛋白;谷胱甘肽转移酶;拓扑异构酶Ⅱ;多药耐药;化疗

  Significance of Testing Multiple Drug Resistance Gene of Gastric Carcinoma in Guiding Clinical Chemotherapy

  JIA Changhe1, KANG Yi1, WANG Wenyu2, REN Ying3

  1. Department of Gastroenterology, He'nan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450003, China, 2. Department of Oncology,3. Department of PathologyAbstract:Objective To test the expressions of multiple drug resistance (MDR) gene of human gastric carcinoma, and investigate its significance in guiding gastric carcinoma clinical chemotherapy by choosing appropriate remedy according to examination result.Methods Eighty gastric cancer patients diagnosed by endoscopy and pathology were random divided into two groups (fit group and nonfit group),each included 40 patients. The expression of Pgp、GSTπ、TopoⅡ was tested in 80 gastric cancer specimen using immunohistochemistry. The fit group patients were treated by choosing sensitive chemical remedy fitting for gene examination result.The nonfit group patients were treated with the experiential chemotherapeutic scheme of FOLFOX4. Results Positive expression rates of Pgp、GSTπ、TopoⅡ in 80 cases of gastric cancer were 51.5%、57.5%、46.3%,respectively. There were some correlations between the positive expression of Pgp、TopoⅡ and the degree of tumor differentiation,which was higher in well differentiated tumor than that in poor differentiated one for Pgp,but it was reverse for TopoⅡ. There were no correlations between the positive expression of GSTπ and the degree of tumor differentiation. The response rate was 57.5% in the fit group,which was 35% in the nonfit group. There were significant different between the two groups (P<0.05). Conclusion The mechanisms of drug resistance of Pgp、GSTπ、TopoⅡ in gastric cancer are different.It is of significance for guiding gastric cancer clinical therapy by applying the different,sensitive,scientific individual chemotherapy according to the detection results of drug resistance gene, and is helpful to achieve better chemotherapy efficacy for gastric cancer patients.

  Key words:Gastric carcinoma;Pgp;GSTπ;TopoⅡ;Multiple drug resistance;Chemotherapy

  胃癌是一种常见肿瘤,在我国其发病率和死亡率均位于恶性肿瘤的首位,由于就诊时大多数患者处于中晚期,失去了手术治疗机会,因此,化疗成为治疗的主要手段,但由于耐药的产生,疗效往往不佳。如何提高化疗效果,减少耐药性是临床治疗的难点。近年来的研究表明,肿瘤的耐药机制主要表现为P糖蛋白(Pgp)过度表达,谷胱甘肽S转移酶π(GSTπ)活性增强以及拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)含量减少或性质改变等[1]。由于Pgp、GSTπ、TopoⅡ的耐药机制各不相同,所对应的耐药药物也不尽相同,因此临床治疗时应尽量选用敏感的化疗药物。本研究试图通过检测耐药基因表达情况,然后选择相应的敏感药物进行适配化疗,以评价胃癌的治疗效果。

  1 资料与方法

  1.1 临床资料

  所有80例患者均为2005~2007年在我院胃镜检查病理证实的胃癌患者,其中男53例,女27例;年龄36~73岁,平均56岁;所有病例入组前均未行化疗、放疗。组织学类型:高中分化腺癌32例,其他低分化、未分化腺癌、印戒细胞癌共48例。

  1.2 入组标准

  根据预先编排的随机数字将依次入选的80例患者随机分为两组——适配组和非适配组。每组均为40例。两组患者年龄、性别、组织学类型均无显著差异。入选标准为:(1)有病理学诊断依据的胃癌患者;(2)预计生存3个月以上;(3)Karnofsky功能状态(KPS)评分≥60分;(4)签署化疗同意书。

  1.3 耐药基因表达检测

  应用免疫组化方法对80例患者的胃镜活检石蜡切片标本进行检测。鼠抗人Pgp、GSTπ、TopoⅡ单克隆抗体及SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司,操作按说明书进行。磷酸盐缓冲液(PBS, pH=7.2) 代替第一抗体作阴性对照,用已知阳性的结肠癌组织作阳性对照。SP免疫组织化学染色方法如下:(1)切片常规脱蜡至蒸馏水;(2)滴加3%过氧化氢甲醇溶液,室温15min,处理灭活内源性过氧化物酶,PBS冲洗3min×3次;(3) 置0.01M柠檬酸盐缓冲液中微波加热至沸腾后断电,间隔5min后反复1次,以修复抗原,冷却后用PBS液洗涤3min×3次;(4)滴加抗原修复液,室温10min后,PBS液洗涤3min×3次;(5)每张切片滴加50μl非免疫性动物血清,室温15min,弃去多余液体,不洗;(6)滴加一抗(抗Pgp,抗TopoⅡ和抗GSTπ抗体),湿盒中4℃过夜(至少10h),然后PBS冲洗3min×3次;(7)每张切片滴加50μl生物素标记的第二抗体,15min,PBS冲洗3min×3次;(8)每张切片滴加50μl链霉素亲和素抗生物素过氧化酶溶液,15min,PBS冲洗5min×4次;(9)每张切片滴加1滴新鲜配置的DBA显色剂,室温显色,显微镜下控制反应时间(观察3~10min),显色满意后自来水充分洗涤;(10)苏木精浅染5~10s,浸入流动的自来水中充分洗涤;(11)梯度乙醇脱水干燥,二甲苯透明,中性胶封片,室温晾干,光学显微镜观察阳性细胞。

  1.4 检测结果判断

  阳性细胞呈棕黄色细颗粒状,GSTπ位于细胞核或细胞质内,TopoⅡ位于细胞核内,Pgp定位于细胞质和细胞膜上。每张切片由两名医生双盲观测10个高倍视野内的表达情况,根据肿瘤细胞的阳性数及其染色反应的深浅进行判定,未见阳性表达或阳性细胞数<5%为阴性(-),阳性细胞数>5%为阳性(+)。

  1.5 治疗方法

  适配组患者根据耐药基因检测结果选用相对敏感的适配化疗方案,供选择的化疗药物分为以下几种:(1)植物类:紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康;(2)重金属类:顺铂、奥沙利铂;(3)抗代谢类:5Fu、替加氟、卡培他滨;(4)增效剂:亚叶酸钙。具体化疗用药见表1。非适配组患者统一选用FOLFOX4方案化疗。除化疗外2组患者对症支持治疗措施基本相同,观察期内不辅助应用中药及免疫制剂。每组患者接受研究的化疗时限为2周期,2周期结束后部分有手术指征的患者转外科手术,部分无手术指征或不愿手术者继续接受化疗。表1 适配组40例患者具体用药及疗效

  1.6 化疗效果评价

  分别于化疗前1周内和2个周期化疗结束后1周内测量病灶变化。病灶变化主要指肿瘤病灶大小的改变,通过胃镜、上消化道钡餐、CT或 MRI进行评估。按 WHO实体瘤近期疗效评价标准,分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD),以CR+PR为有效。

  1.7 统计学方法 采用χ2检验进行统计。

  2 结果

  2.1 Pgp、GSTπ、TopoⅡ表达率

  Pgp、GSTπ、TopoⅡ总表达率分别为51.5%、57.5%、46.3%;高中分化者中Pgp表达率(65.6%)显著高于其他非高中分化者(41.7%), 而Topo Ⅱ表达率(31.3%)显著低于其他非高中分化者(56.3%),(P均<0.05);GSTπ的表达在高中分化者与非高中分化者之间无显著差异, 见表2。3种基因均耐药有10例(12.5%),两种基因均耐药有35例(43.8%),见表3。表2 耐药基因表达与组织分化关系 非适配组有效率35%(14/40),适配组有效率57.5%(23/40),其中完全适配病人有效率为64.3%。两组有效率比较差异有统计学意义(P<0.05), 见表4。表4 2组患者化疗有效率比较

  3 讨论

  Pgp含1 280个氨基酸,为膜转运蛋白,具有通道蛋白的性质。Pgp在ATP的参与下可与多种药物结合,并以主动耗能的方式将扩散进人细胞的亲脂类药物泵出细胞外,从而使细胞内药物浓度降低,导致细胞耐药[2]。Pgp表达阳性的肿瘤细胞对亲脂性抗癌药物耐药,如抗生素类、植物类、生物碱类,对烷化剂、抗代谢类化疗药则敏感[3]。谷胱甘肽S转移酶(glutathionstransferase,GST)是一组多功能药物代谢酶,与细胞内解毒密切相关,临床应用的许多药物都在GST催化下通过谷胱甘肽(GSH)结合而解毒。GST根据等电的不同可分为碱性、中性、酸性三种。其中酸性GST(GSTπ)是肿瘤细胞和组织中最常见的同功酶,在许多耐药细胞特别是MDR表型的细胞中高表达。GST主要通过将GSH藕联到化疗药物上,增加毒性药物的外流而减少细胞毒性[4]。GSTπ阳性者对烷化剂、蒽环类、铂类化合物等耐药[5]。TopoⅡ是一种能将DNA由一种拓扑异构体变为另一种拓扑异构体的酶,是真核细胞不可缺少的一种重要核酶。具有切割、旋转和重接DNA的功能,还参与基因重组、转录、姐妹染色单体分离和 DNA修复[6]。以TopoⅡ为靶酶的化疗药物主要有两种作用机制[7]:(1)通过和TopoⅡDNA结合成稳定的断裂复合物,促使DNA的断裂,并阻止TopoⅡ对断裂链的再连接,导致DNA断链的错误修复,激发细胞死亡的生化过程而达到杀伤肿瘤细胞的作用;(2)直接通过抑制TopoⅡ活性发挥抗肿瘤作用。因此,TopoⅡ介导的耐药性的基础即在于TopoⅡ含量的减少和(或) TopoⅡ活性的降低。TopoⅡ表达阴性者对天然或半天然抗癌药如阿霉素、长春碱、VP16、羟基喜树碱等耐药[8]。

  既往研究显示Pgp、GSTπ、TopoⅡ在胃癌中均有不同程度的表达,且与肿瘤生物学行为有一定关系[911]。本研究中Pgp、GSTπ、TopoⅡ在胃癌组织中的总表达率分别为51.5%、57.5%、46.3%;高中分化者中Pgp表达率(65.6%)显著高于其他低分化、未分化腺癌、印戒细胞癌等非高中分化者(41.7%), 而Topo Ⅱ表达率(31.3%)显著低于其他非高中分化者(56.3%),提示两者与胃癌组织学类型有关,这与多数低分化胃腺癌对抗癌药较敏感的现象相符。GSTπ的表达在高中分化者与非高中分化者之间无显著差异,与胃癌组织学类型无关。

  本研究结果显示3种基因检测结果均提示耐药表型者只占少数(12.5%),因此只要选择合适的敏感药物进行化疗理论上可以提高胃癌化疗效果。从研究结果看,适配组患者根据耐药基因表达情况选择相对敏感的药物化疗,其总有效率(57.5%)明显高于非适配组的FOLFOX4传统经验方案(35%),完全适配者有效率更高(64.3%)。

  根据以上研究,我们认为依据耐药基因的检测结果针对不同患者,实施科学的、药物适配的个体化化疗方案对胃癌治疗具有重要的指导意义。

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