川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC7901/ADR的杀伤作用

　　作者：杨 叶，侯培珍，张 娟 作者单位：内蒙古包头医学院第一附属医院急诊科

　　【摘要】 目的 观察川芎嗪(TMP)联合氟尿嘧啶(5Fu)对胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR细胞的体外杀伤作用。方法 采用MTT法观察TMP联合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用，光镜下观察并采用流式细胞仪(FCM)测定各药物组细胞周期的分布。结果 5Fu对SGC7901/ADR细胞的半数抑制率(IC50)为13.001mg/L，与300mg/L TMP联合后，使其的IC50降至1.542mg/L，逆转倍数是8.43倍，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。光镜下可见5Fu+TMP(终浓度300mg/L)组较5Fu组癌细胞皱缩变小变圆，出现凋亡改变。FCM分析：TMP联合5Fu与对照组相比将细胞阻滞在DNA合成前期和静息期G0/G1期(P<0.05)。结论 TMP与5Fu联合对胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR有较强的杀伤作用，为当前胃癌治疗提供了新思路。

　　【关键词】 胃癌;多药耐药性;SGC7901/ADR细胞;5Fu;川芎嗪

　　Lethal Effect of Combination of Tetramethylpyrazine and Fluorouracil in Multidrug Resistance of Gastric Carcinoma Cell Lines SGC7901/ADR

　　YANG Ye，HOU Peizhen，ZHANG Juan

　　The Emergency Department of First Affiliated Hospital，BaoTou Medical College，BaoTou 014010，China

　　Corresponding Author：HOU Peizhen，Email：houpeizhen@126.comAbstract：Objective To investigate the lethal effect of combination of TMP and 5Fu in the multidrug resistance of Gastric Carcinoma Cell Lines SGC7901/ADR. Methods Gastric carcinoma cell lines SGC7901 and the multidrug resistance cell lines SGC7901/ADR were considered as target cells, MTT assay was used to investigate the lethal effect of combination of TMP and 5Fu in vitro,which was observed by Light microscope. Flow cytometer(FCM) was employed to investigate the cell cycles. Results The half inhibition ratio(IC50)of 5Fu against SGC7901/ADR was 13.001 mg/L, which was reduced to 1.542mg/L by 300mg/L TMP,The reversal index was 8.43(P<0.01).Malignant cell volume and morphous which exposed to 5Fu+TMP became smaller and strinked rounder by Light microscope. FCM revealed that with the effect of 5Fu+TMP,cell cycle was blocked at presynthetic phase and ambiguous phaseG0/G1 phase and The cells enter the period of DNA synthesis were reduced,inhibition mitosis of SGC7901/ADR(P<0.05). Conclusion Combination of 5Fu and TMP has stronger lethal effect against the multidrugs resistance Cell Lines SGC7901/ADR in Gastric Carcinoma,which may provid a new therapeusis against Gastric Carcinoma.

　　Key words：Gastric Carcinoma;MDR;SGC7901/ADR;5Fu;TMP

　　胃癌多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是其化疗失败的主要原因之一[1]。目前，解决MDR主要方法是通过增加细胞内药物浓度而逆转MDR，但多数逆转剂的毒副作用限制了它们的临床应用。本实验观察低毒、价廉的新型钙通道阻滞剂[2]川芎嗪(TMP)联合氟尿嘧啶(5Fu)对胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR的杀伤作用，为胃癌MDR的治疗提供新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系

　　人胃癌细胞株SGC7901细胞、耐阿霉素药细胞株 SGC7901/ADR细胞，均由第四军医大学西京医院消化研究所惠赠。

　　1.2 药物、试剂及主要仪器

　　TMP(北京永康药业有限公司产品)，5Fu(南通精华制药有限公司产品)，阿霉素(ADM)(汕头经济特区明治医药有限公司产品)，RPMI1640(美国GIBCO公司产品)，新生小牛血清(杭州四季青生物研究所产品)，MTT、DMSO、胰蛋白酶(美国sigma公司产品)，流式细胞仪试剂盒(Exalpa公司产品)，倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品)，酶标仪(美国Biotek公司产品)，流式细胞仪(美国BD公司产品)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞培养 将SGC7901细胞置于10%新生小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中。SGC7901/ADR细胞置于含1.0μg/ml ADM的上述培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养。SGC7901/ADR细胞实验两周前培养于不含ADM的培养液中。

　　1.3.2 TMP的非细胞毒性剂量 采用MTT法，取对数生长期的SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞，以5×104/ml接种于96孔细胞培养板上，培养24h。实验孔加入不同浓度的TMP(100、200、300、400、500mg/L)。每浓度设5个复孔，培养48h，加入20μl(5g/L)MTT，4h后加入DMSO150μl，摇床摇匀，以酶标仪490nm波长测定各孔吸光度A值。计算不同药物浓度下细胞的存活率SR[3](SR=实验组A值/对照组A值×100%)。当细胞存活率SR≥95%[4]时，确定为本实验的非细胞毒性剂量。

　　1.3.3 TMP联合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用 方法同上，在SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞中加入①不同浓度5Fu(1×101～1×105μg/L)，②不同浓度5Fu(1×101～1×105μg/L)和非细胞毒性剂量的TMP。计算不同药物浓度下细胞的SR、半数抑制浓度IC50、相对耐药性RF[5] (RF=耐药细胞株IC50/胃癌细胞株IC50)及逆转倍数RI(RI=单独用药IC50/联合逆转剂后IC50)。

　　1.3.4 FCM分析细胞周期 收集经过不同浓度药物处理的SGC7901/ADR细胞，PBS洗涤后，70%冷乙醇固定过夜，离心去乙醇，加入1%RNA酶溶液及碘化丙啶(PI)染液，黑暗避光37℃水浴20min，经特制的尼纶网滤器过滤(冰上操作)于检测管内，上流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料用CELLQUEST软件进行分析。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS11.5统计软件包，进行回归分析及方差分析。

　　2 结果

　　2.1 TMP的非细胞毒性剂量

　　TMP在300mg/L浓度以下时，SGC7901/ADR细胞的存活率在95%以上，且相同剂量TMP对敏感细胞无明显毒性作用。故TMP在300mg/L浓度以下为非细胞毒性剂量，见表1。表1 TMP在不同浓度下对肿瘤细胞存活率的影响

　　2.2 TMP联合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用

　　SGC7901/ADR细胞对5Fu具有耐药性，相对耐药性为97.49。100～300mg/L TMP对其耐药性有逆转作用且呈剂量依赖关系(R=0.972，P=0.000)。300mg/L TMP能显著增加SGC7901/ADR细胞对5Fu的敏感性，使其相对耐药性降至12.89，逆转倍数为8.43倍。300mg/L TMP联合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用最强(P<0.01)，见表2。光镜下可见300mg/L TMP加强了5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用，癌细胞皱缩变小变圆，细胞出现凋亡改变，见图1。表2 TMP对SGC7901/ADR细胞耐药性的逆转作用

　　2.3 细胞周期分析

　　FCM分析证实TMP(终浓度300mg/L)与5Fu联合应用后，使SGC7901/ADR细胞周期阻滞在DNA合成前期和静息期(G0/G1期)的细胞百分比明显高于5Fu组，进入DNA合成期(S期)、DNA合成后期和有丝分裂期(G2/M期)细胞百分比明显低于对照组(P<0.05)，从而抑制癌细胞DNA的合成和有丝分裂，诱导细胞凋亡，见表3。表3 TMP对肿瘤细胞周期的影响

　　3 讨论

　　肿瘤产生多药耐药性(MDR)的主要机制是P糖蛋白(P glycoprotin，Pgp)及多药耐药性相关蛋白(multidrug resistence associated protein，MRP)的过表达[6]，引起药物外流及细胞内药物积蓄减少。本研究证实：SGC7901/ADR细胞对5Fu具有耐药性，相对耐药性为97.49。

　　TMP为中药川芎的主要有效成分，属酰胺类生物碱。近年来发现，TMP可通过多种途径对肿瘤起到治疗和辅助治疗的作用。其钙通道阻滞活性，可部分纠正小鼠腹水癌对阿霉素的抗药性[7]。100～320mg/L的非细胞毒浓度范围内，能增加HL60/VCR细胞对多种化疗药物的敏感性[8]。本实验结果显示， TMP与5Fu配伍没有发生任何药物颜色的改变或沉淀形成，100～300mg/L均可提高SGC7901/ADR细胞对5Fu的敏感性，对5Fu耐药性的逆转作用呈剂量依赖关系，其中以300mg/L TMP作用最强(P<0.01)，这可能与TMP的Ca2+拮抗作用有关,大剂量的TMP更能有效降低细胞膜电荷，间接影响Pgp功能[9]，从而提高耐药细胞内5Fu的药物浓度而发挥药理作用。FCM证实两药联合使细胞周期阻滞在G0/G1期，有效抑制癌细胞DNA的合成和有丝分裂，诱导其凋亡(P<0.05)。5Fu 联合TMP具体作用机制，是否通过降低多药耐药基因MDR1的高表达，影响Pgp功能，从而提高细胞内5Fu的浓度增强化疗效果，此结果有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

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　　[3]Britton RA,Green JA,Warenius HM.Cellular glutathione(GSH) and glutathione Stransferase (GST) activity in human ovarian tumor biopsies following exposure to alkylating agents[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,24(3):527531.

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　　[9] 杨牡丹,李亮成.胃癌多药耐药基因研究进展[J].山西临床医药杂志,2001,10(3):163166.