肝癌组织中1433σ启动子异常甲基化及基因转录水平检测

    作者：李海平，张吉才，冯 景，余宗涛，吕 军    作者单位：湖北十堰，郧阳医学院附属太和医院     【摘要】  目的 探讨肝癌1433σ基因启动子异常甲基化状况及其与转录水平的关系。方法 1433σ启动子甲基化用甲基化特异性PCR检测； 1433σ mRNA的表达水平用实时定量PCR检测。结果 1433σ启动子甲基化在肝癌患者癌旁组织、肝硬化组织和癌组织中的阳性率分别为6.8%(3/44)、56.1％（23／44）和93.2%(41/44)。不同性别、分化程度和乙型肝炎病毒状态的组织中1433σ甲基化频率无显著差异（P>0.05）；发生甲基化的组织标本中90.6%(58/64) 转录缺失，10.4%转录水平下降，而未发生甲基化的标本1433σ mRNA表达水平基本正常。1433σ甲基化与其mRNA水平明显负相关（P<0.05）。1433σ甲基化与其mRNA表达水平下降密切相关（P<0.05）。结论 从癌旁组织、肝硬化组织到癌组织，1433σ基因启动子甲基化频率逐步升高，且与其mRNA表达相关，提示1433σ启动子甲基化可能在肝癌形成过程中是一个早期事件，与肝癌发生有一定关系。

    【关键词】  肝癌；1433σ；启动子；甲基化；表达

    Detection of Promoter Hypermethylation and mRNA Expression of 1433σ Gene in Tissues of Human Hepatocellular Carcinoma

    LI Haiping,ZHANG Jicai,FENG Jing,YU Zongtao,LV  Jun

    Taihe Hospital Affiliated of Yunyang Medical College， Shiyan 442000, China

    Corresponding Author: ZHANG Jicai,Email:adamzhang418@yahoo.com Abstract：Objective   To investigate promoter methylation status , mRNA expression of 1433σ gene and their relationship in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods  The methylation status of the 1433σ gene in tissues were detected with methylationspecific PCR.The 1433σ mRNA expression was examined by realtime PCR.Results  Hypermethylation of CpG islands of the 1433σ gene was detected in 93.2% (41/44) of the HCC tissues, 56.1％（23/41）of cirrhotic tissues and 6.8%(3/41) of canceradjacent tissues,no significant difference between different clinical pathological features,such as gendre,differentiation and HBV infection status. mRNA expression of 1433σ in tissues without methylated product approximated to the normal level,whereas, that in 58/64 (90.6%) of samples with methylated product were lower than the detection limit,10.4% were lower than the normal level. The expression and methylation of 1433σ were negatively correlated（P<0.05）.Conclusion  These results indicate that hypermethylation plays a causal role in inactivation of the 1433σ gene in HCC. Hypermethylation and the resulting loss of expression of the 1433σ gene corresponds to one of the most common abnormalities reported to date in HCC, suggesting their crucial role in the development of HCC.

    Key words：Hepatocellular carcinoma; 1433σ; Promoter; Methylation; Expression

1433σ抑癌基因定位于1p35，负责G2细胞周期检查点的调控，在DNA损伤修复中起重要作用。在原发性膀胱癌、肠癌和乳腺癌中其蛋白的表达明显下调。随着表现遗传学研究的深入，发现基因启动子区甲基化是1433σ基因表达失活的主要机制之一,但在肝癌中的情况少见报道。本研究用甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR,MSP）检测肝癌组织中1433σ基因启动子区甲基化状况， 用SYBR green I 实时定量PCR检测1433σ mRNA 在肝癌中的转录水平，进而探讨1433σ基因甲基化与其转录的关系，以及1433σ基因启动子甲基化在肝癌形成过程中的作用。

    1  资料与方法

    1.1  资料

    1.1.1  资料来源  44例肝癌患者均来自郧阳医学院附属太和医院的2002年3月～2005年12月住院患者，男35例，女9例，平均年龄50岁（37～67岁），经病理学诊断确诊。术后取癌组织、肝硬化组织和癌旁组织。

    1.1.2  主要试剂与仪器  Wizard DNA clean up kit、Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(Promega)；PCR试剂（华美公司）；SYBR Green Ⅰ(基因公司)；对苯二酚和亚硫酸氢钠(Sigma公司)。PE7000(美国ABI公司)、DU640紫外分光光度计(德国贝克曼公司)。

    1.1.3  引物合成  由大连宝生物公司合成。1433σ甲基化引物[1]( 5’TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC3’, 5’CCTCTAACCGCCCACCACGG3’);产物长度为 bp; 1433σ非甲基化引物[1] (5’ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT3, 5’CCCTCTAACCACCCACCACA3’); 1433σ mRNA引物[1]（5’GTGTGTCCCCAGAGCCATGG3’, 5’ACCTTCTCCCGGTACTCACG3’）; 参比基因GAPDH mRNA引物[1]( 5’TCATTGACCTCAACTACATGGTTT3’, 5’GAAGATGGTGATGGGATTTC3’)。

    1.2  方法

    1.2.1  组织DNA提取  以经典酚氯仿抽提法提取DNA，经紫外260 nm定量后于80 ℃保存备用。

    1.2.2  组织RNA提取  用Trizol提取RNA，按说明书进行操作。提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即逆转为cDNA。

    1.2.3  cDNA的合成  应用A3500试剂盒，按说明书操作。简介如下:取2 μl（约1μg）提取总RNA于PCR扩增管中，在PCR扩增仪70℃扩增10 min，立即置于冰块上，再加入下列成份：25 mmol/L氯化镁4 μl，逆转录10倍缓冲液2 μl，10 mmol/L dNTP混合液2μl，Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl，AMV逆转录酶15 u，Oligo(dT)15 Primer 0.5 μg，加无核酸酶双蒸水至20 μl。离心20 s置PCR仪，42℃ 15 min，95℃ 5 min后立即放置在冰块上备用。

    1.2.4  SYBR Green Ⅰ实时定量RTPCR  用无RNA酶的双蒸水稀释cDNA至100 μl，PCR反应体系如下：加入稀释的cDNA液5 μl，2 mmol/L dNTP混合液3 μl，25 mmol/L氯化镁3 μl，10×buffer 3 μL，上下游引物（50 pmol/L）各2μl，Taq DNA聚合酶2u，20倍SYBR Green Ⅰ 0.75 μl，加无核酸酶双蒸水至30μl。扩增：（95 ℃ 60 s ,58 ℃ 30 s ,72 ℃60s, 83℃ 10 s），40个循环，在83℃读取荧光值。

    1.2.5  1433σ基因相对定量方法  利用检测得到的Ct 值和计算得到的扩增效率，以GAPDH mRNA为参照，计算1433σ mRNA的相对量。1433σ mRNA/ GAPDH mRNA=(1 + EGAPDH) Ct (GAPDH) / (1 + E1433σ) Ct(1433σ) [2]。

    1.2.6  基因组DNA 的修饰  参照文献[3]进行。取4 μg (调整为50 μl)基因组DNA加到50 μl终浓度为0.3 mol/ L的NaOH 碱性液中，37 ℃孵育，15 min变性;加入临时配制的3 mol/ L亚硫酸氢钠(pH 5.0) 520 μl与10 mmol/ L的氢醌30 μl轻轻混合，再加入0.2 ml矿物油覆盖，55℃温箱16 h;经过碱基修饰的DNA用Wizard DNA CleanUp System进行脱盐、纯化回收，50 μl去离子水中洗脱;加入3 mol/ L NaOH 5.5 μl ，37℃水浴箱30 min终止反应，加入55 μl 10 mol/L醋酸氨、2 μl糖原(5 mg/ml)及2.5倍体积的预冷无水乙醇沉淀。离心干燥后重新溶于50 μl去离子水中，置-40℃备用。

    1.2.7  MSP  体积为30 μl的反应液中含10×PCR缓冲液3 μl，Mg2+2.5 mM，dNTPs 250μM，每条引物各0.22 μM,取1.2.6中修饰过的DNA样品4 μl(约50 μg),TaqDNA聚合酶(日本Takara公司)2.0 U。在PE7000上进行扩增：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，38个循环，最后1个循环70℃延伸5 min。将MSP产物与上样缓冲液按5∶1混合后，于2.5%琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在紫外线下检测、照相。人类胎盘组织DNA经甲基化酶Sss I转化后作为甲基化的阳性对照,健康人淋巴细胞DNA作为甲基化阴性对照。

    1.2.8  统计学方法  用SPSS12.0软件分析，mRNA定量测定用t检验，启动子甲基化状况用卡方检验,不符合χ2检验者用Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  肝癌组织1433σ基因启动子甲基化情况

    肝癌患者癌旁组织、肝硬化组织和癌组织中1433σ启动子甲基化阳性率分别为6.8%(3/44)、56.1％（23／44）和93.2%(41/44)。阳性结果见图1。不同性别、HBV感染状态、分级肝癌患者1433σ基因甲基化的阳性率见表1,差异无显著统计学意义(P>0.05)。

    2.2  1433σ基因启动子甲基化与1433σ基因转录的关系 表1  1433σ基因甲基化状况与肝癌病理特征间的关系用实时定量PCR    检测了1433σ mRNA表达水平，结果见图2。41例发生甲基化的癌组织中40例呈现1433σ mRNA转录缺失（38个PCR循环未能检出），1例表达水平降低；23例发生甲基化的肝硬化组织中有18例1433σ mRNA表达缺失，5例表达水平降低；3例甲基化癌旁组织中表达水平降低。总计，发生甲基化的组织标本中90.6%(58/64) 转录缺失，9.4%下降，而未发生甲基化的标本表达水平基本正常。1433σ甲基化与其mRNA水平明显负相关（P<0.05）。

    3  讨论

    DNA甲基化是由甲基化酶介导的在DNA某些碱基上增加一个甲基的化学修饰过程。肿瘤细胞中DNA甲基化主要表现为两种形式：启动子区域超甲基化(promoter hypermethylation)和基因组整体甲基化水平降低(global hypomethylaiton)。基因组整体甲基化水平降低可导致基因组稳定性降低和癌基因激活；而发生在启动子区域的甲基化则是抑癌基因表达失活的重要原因之一。

    G1/S和G2/M检查点是细胞癌变过程中两个细胞周期调控点,均受多种抑癌基因调控。在以前的研究中我们发现的调控G1/S检查点的抑癌基因p16异常甲基化参与肝癌的形成过程,并与HBV病毒感染有关[4]。1433σ通过对p53的作用而调控G2/M检查点，高表达于正常上皮组织，通过细胞周期蛋白CDKS复合物的磷酸化作用而参与细胞周期调控,抑制细胞进入增殖周期,阻止分裂,促进终末分化,诱导凋亡,被认为是一种重要的细胞周期负调控子。目前研究发现1433σ在乳腺癌中有着较高的甲基化频率[58]，其甲基化改变与乳腺癌的发生发展的关系极为密切。Ferguson等[1]发现48例乳腺癌中有45例呈现1433σ mRNA转录下调，且与1433σ基因异常甲基化有关。我们以前的研究也说明1433σ在乳腺癌中转录表达与其基因启动子甲基化关系密切[9]。

    其甲基化在肝癌中的作用尚未明确。我们利用MSP法检测了肝癌患者的癌旁组织、硬化组织和癌组织中1433σ基因甲基化情况。发现在肝癌患者的癌组织存在很高的甲基化频率，与国外报道基本一致[10]。除此之外，我们还在肝癌患者的肝硬化组织和癌旁组织中也检测到1433σ甲基化产物，并且从癌旁组织、肝硬化组织到癌组织其阳性率呈现逐步上升趋势。因肝硬化是肝癌形成的前期阶段，这提示1433σ甲基化可能是肝癌形成的早期事件之一，参与肝癌形成过程。不同性别、肿瘤分化程度肝癌组织中1433σ甲基化频率无显著差异也进一步说明这一点。与G1/S检查点调控基因p16不同的是，本试验中未发现1433σ甲基化与HBV感染有关，原因不明可能是HBV促甲基化作用有一定选择性。

    基因启动子甲基化是抑癌基因表达失活或沉寂的重要原因。SYBR green I 是一种与双链DNA的小沟结合的荧光染料，它无需探针设计，实验难度低，是一种简便实用的荧光定量PCR技术。我们用SYBR green I 实时定量PCR检测了1433σ mRNA转录水平。发现 90.6%组织1433σ发生甲基化后未能检测到其mRNA表达水平，10.4%表达量降低。说明在肝癌中1433σ启动子甲基化是其mRNA表达水平下降的重要原因之一。

    总之，我们通过检测肝癌组织中1433σ基因启动子甲基化及其表达情况。发现肝癌形成过程中1433σ基因启动子甲基化频率呈逐步升高趋势，且其启动子甲基化与其mRNA表达水平下降密切相关。这些说明1433σ启动子甲基化是肝癌形成过程中的早期事件之一，在肝癌的发生中起一定作用。

【参考文献】[1] Ferguson AT,Evron E,Umbricht CB,et al.High frequency of hypermethylation at the 1433 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer[J]. PNAS,2000，94: 60496054.

[2] 陈英剑,胡成进,赵苗青.大鼠TGFβ mRNA 表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RTPCR 方法的建立[J].中国实验诊断学,2005,9:279281.

[3] Hrman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acid Sci USA,1996,93(18):98219826.

[4] Jicai Zhang,Zongtao Yu, Jun Lu,et al.Persistent infection of hepatitis B virus is involved in high rate of p16 methylation in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Carcinog，2006，45(7):530536.

[5] Yuan Y,Mendee R,Sahim A,et al. Hypermethylation leads to silencing of the SYK gene in human breast cancer[J]. Cancer Res, 2001,61(14):55585561.

[6] Yang H，Wen YY，Zhao R，et al. DNA damageinduced protein 1433σ inhibits protein kinase B/Akt activation and suppresses Aktactivated cancer[J]. Cancer Res, 2006，66(6): 3096 3105.

[7] Henrique R, Jerónimo C，Hogue MO，et al. Frequent 1433σ promoter methylation in benign and malignant prostate lesions[J]. DNA Cell Biol, 2005，24(4):264269.

[8] Umbricht CB, Evron E, Gabrielson E, et al. Hypermethylation of 1433 sigma (stratifin) is an early event in breast cancer[J].Oncogene,2001，20(26): 33483353.

[9]吕军，冯景，周有利，等.散发性乳腺癌癌变过程1433σ异常甲基化与其转录水平的关系[J]. 中国癌症杂志, 2007,23(3):241244.

[10]Iwata N, Yamamoto H, Sasaki S, et al. Frequent hypermethylation of CpG islands and loss of expression of the 1433σ gene in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene，2000，19(46):52985302.