米非司酮对绒癌细胞体外增殖及对非经典人类 白细胞Ⅰ类抗原表达的影响

    作者：王建英，李 勇，程建新，范立侨，吴小华，赵 群，王世杰    作者单位：石家庄，河北医科大学第四医院妇产科    【摘要】  目的 探讨米非司酮对绒癌细胞JEG3体外增殖及对非经典人类白细胞I类抗原HLAG、HLAE表达的影响。方法 体外培养高表达HLAG、HLAE的绒癌细胞株JEG3，采用MTT法检测米非司酮对细胞增殖的影响，分别通过RTPCR技术和流式细胞分析技术观察其对细胞中HLAG、HLAE mRNA和蛋白水平表达的影响。结果 米非司酮对JEG3细胞的增殖表现出浓度信赖性的抑制作用，高浓度米非司酮能明显下调JEG3细胞中HLAG、HLAE mRNA和蛋白水平。结论 米非司酮抗肿瘤的机制之一可能是其可以打破机体对肿瘤的免疫耐受，从而遏制肿瘤的生长。

    【关键词】  米非司酮;人类白细胞抗原;免疫耐受

    Effect of Mifepristone on  Proliferation and  Expression of  Nonclassical Human Leucocyte Antigen Class Ⅰ Molecules in Choriocarcinoma Cell Line

    WANG Jianying1,LI Yong2,CHENG Jianxin1,FAN Liqiao2,WU Xiaohua1,ZHAO Qun2,WANG Shijie2

    1.Department of Gynecolory and Obstetric,The Forth Hospital of Heibei Medical University,Shijiazhuang 050011,China,2.Department of SurgeryAbstract：Objective   To explore the effect of mifepristone on the proliferation and the expression of nonclassical HLA I molecules (HLAG and HLAE) in choriocarcinoma cell line JEG3.Methods  The HLAG highly positive cell line of choriocarcinoma(JEG3) was cultured in vitro,and MTT assay was used to examine antiproliferative effect of mifepristone on the JEG3 cells,the mRNA expression of HLAG and HLAE were detected  by RTPCR,and protein level by flow cytometry.Results  Mifesitone produced concentrationdependent and timedependent antiproliferative effect on JEG3 cell at all experimental concentrations.Highconcentration mifesitone could significantly downregulate both mRNA and protein expression of HLAG and HLAE.Conclusion  One of mifesitone’s antineoplastic mechanisms is surmounting immune tolerance to the neoplasm and inhibit its growth.Key words    Mifesitone    Human Leucocyte Antigen    immune tolerance.

    Key words：Mifestitone;Human Leucocyte antigen;Immune tolerance 研究表明人类白细胞抗原G（human leukocyte antigen G,HALG）和人类白细胞抗原E（human leukocyte antigen E,HLAE）可通过免疫抑制途径，在肿瘤发生过程中起到免疫逃逸作用[1]。

    许多体内外实验证明，米非司酮对于性激素依赖性的妇科肿瘤有明显的抗肿瘤作用，但作用机制不太清楚，其作用是否与下调HLAG、HLAE有关，目前尚未见报道。本研究将米非司酮直接作用于高表达HLAG和HLAE的绒癌细胞株JEG3，观察米非司酮对JEG3细胞的杀伤活性及对该细胞中HLAG、HLAE水平的影响，探索米非司酮的抗肿瘤机制，为临床应用提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  绒毛膜癌细胞JEG3，购于中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重点实验室。

    1.1.2  试剂  米非司酮纯品（RU486）由北京紫竹药业有限公司提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于Sigma公司；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒购于Fermentas公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；HLAG、HLAE单克隆抗体购于英国Abcam公司。

    1.2  方法

    1.2.1  JEG3细胞培养  用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素、2mmmol/L的DMEM/F12培养液，在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养,以0.25%胰蛋白酶消化，2～3天传代一次。

    1.2.2  MTT法检测米非司酮对JEG3细胞增殖的影响  米非司酮以无水乙醇溶解，配成10mg/ml，再以RPMI1640培养液稀释至所需浓度，试验组米非司酮终浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml。为避免乙醇对试验的影响，设7个乙醇对照组，使乙醇终浓度与各实验组乙醇含量一致。采用MTT比色法检测细胞的增殖情况，取对数生长期的细胞，调整浓度为2×105 /ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl，贴壁培养24h后分别加入不同浓度的药物，每个浓度设6个复孔，每板设3个空白对照孔。细胞培养设定时间后，每孔加入10μl MTT（浓度为5mg/ml），继续培养4h后，弃培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10min，酶标仪在600nm处测定吸光度(A)值，并按如下公式计算各组细胞的生长抑制率。实验重复5次。

    细胞生长抑制率= (对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%。

    1.2.3  RTPCR技术检测米非司酮对JEG3细胞HLAG、HLAE mRNA水平的影响  试验组米非司酮终浓度为40μg/ml、80μg/ml，同时设无药对照组。药物作用于JEG3细胞72h，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA,用紫外分光光度法定量RNA。将等量的RNA反转录为cDNA第1链,以获得的逆转录产物为模板进行PCR,扩增HLAG基因、HLAE基因和βactin 基因。使用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析，以平均灰度值代表相应基因的表达量，并除以βactin的平均灰度值，所得数值做为各扩增产物mRNA的相对表达量。扩增条件为: HLAG为94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min；HLAE为94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火55s，72℃延伸2min，40个循环，72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳80V 30min，观察基因表达变化。引物序列[2]：HLAG上游引物为5′AGA CGC CAA GGA TGG TGG TCA3′，下游引物为5′AGG AAA GGT GAT TGG GGA AGG3′；HLAE上游引物为5′TCC GAG CAA AAG TCA AAT3′，下游引物为5′AGA TCC AAG GAG AAC CAG3′；βactin上游引物5′AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT3′， 下游引物为5′GGA AGG AAG GCT GGA AG3′。扩增产物：HLAG为770bp，HLAE为447bp，βactin为619bp。实验重复5次。

    1.2.4  流式细胞技术测定米非司酮对JEG3细胞HLAG、HLAE蛋白表达的影响  试验组米非司酮终浓度为40μg/ml和80μg/ml，药物作用于JEG3细胞72h，取单细胞悬液1×106/ml，分别加入1∶100的鼠抗人单克隆抗体HLAG、HLAE 100μl，孵育30min，PBS洗涤去上清，加入1∶20羊抗鼠FITCIgG100μl，孵育30min，PBS冲洗未结合抗体，再加入PBS，经500目铜网过滤后上机检测，设本底对照和阴性对照。以荧光指数（FI）表示蛋白的相对含量。实验重复5次。

    1.2.5  统计学方法  数据以±s表示，采用SPSS统计软件进行数据分析，进行F检验。

    2  结果

    2.1  米非司酮对JEG3细胞增殖的影响

    由图1可看出，随着作用时间的延长，同一浓度的米非司酮对细胞的抑制率有逐渐升高的趋势，其中40μg/ml和80μg/ml两个浓度作用细胞72h后抑制率达到50%以上，故选用72h为米非司酮的最佳实验作用时间。

    与空白对照组相比，药物作用72h后，各浓度米非司酮对JEG3细胞均有不同程度的杀伤作用，呈浓度依赖性（P＜0.05）。当米非司酮浓度低于10μg/ml时，抑制作用较弱，但浓度达20μg/ml以上时，抑制作用呈明显上升趋势，当浓度为80μg/ml时，抑制率几乎达到100%。用于溶解米非司酮的乙醇对细胞生长并无明显影响，见图1。

    2.2  米非司酮对JEG3细胞中HLAG mRNA和蛋白水平的影响

    米非司酮作用于JEG3细胞72h后，对照组、40μg/ml组和80μg/ml组之间两两比较，HLAG mRNA和蛋白表达变化均有统计学意义。其中对照组和80μg/ml组相比，P＜0.01；对照组和40μg/ml组、40μg/ml组和80μg/ml组相比，均为P＜0.05。见表1、图2、4。表1  米非司酮对JEG3细胞HLAG、

    2.3  米非司酮对JEG3细胞中HLAE mRNA水平和蛋白水平的影响

    80μg/ml米非司酮作用于JEG3细胞72h后，与对照组相比，HLAE mRNA和蛋白表达均明显降低；40μg/ml组与对照组相比，HLAE mRNA和蛋白水平变化无统计学意义（分别为P=0.164，P=0.2）；40μg/ml组与80μg/ml组相比，mRNA表达降低不明显（P=0.098），蛋白表达降低有统计学意义（P=0.018），见表1、图3、5。

    3  讨论

    机体免疫监视作用的主要效应细胞是CTL(cytotoxic T cell,CTL)和NK细胞，CTL对肿瘤细胞的识别要依赖对肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex,MHCⅠ)类分子的识别。对于不表达MHCⅠ类分子的肿瘤细胞，NK细胞发挥其细胞毒作用以攻击肿瘤细胞。

    与此同时，肿瘤细胞通过多种途径逃避机体的免疫监视作用，包括经典的MHCⅠ类分子丢失或变构，导致CTL杀伤功能的丧失；另外肿瘤细胞在丢失MHCⅠ类分子的同时可高表达非经典的MHCⅠ类分子（如HLAG、HLAE），传递强烈的杀伤抑制信号，致使肿瘤细胞在逃逸CTL的杀伤作用后又逃逸NK细胞的杀伤作用。

    NK细胞受体包括两类，即免疫球蛋白超家族和C型凝聚素超家族，每一类又包括抑制性受体和活化性受体。免疫球蛋白超家族中抑制性受体KIRs(killer cell inhibitory receptor)有ILT2(Iglike transcript 2)和ILT4，识别HLAG。C型凝聚素超家族抑制性受体CD94/NKG2A，识别HLAE[3]。HLAG和HLAE具有相似的NK抑制功能， 其多态性有限，组织分布广泛。HLAG与KIR结合后，激活KIR胞浆部分含有的免疫受体酪氨酸抑制基序，该基序与自身MHCⅠ类分子的结合后，可转导负调控信号，抑制NK细胞活化。HLAE需要与源于其他HLAI类分子等位基因前导序列的特异性肽段结合，这一肽段必须能稳定HLAE的表达，与HLAE结合成为CD94/NKG2A的识别受体，抑制NK细胞及部分T淋巴细胞的细胞毒作用[4]。HLAG和HLAE具有互补或协同作用，前者能促进和稳定后者的表达。

    HLAG的高表达依赖于肿瘤微环境中的活化刺激剂，如IFNγ、GMCSF、IL2、IL10等，均可增强HLAG蛋白的表达，对HLAE表达也有一定促进作用[5，6 ]。因其在胎盘母体面绒毛膜外细胞滋养层大量表达，陈春玲等[7]研究发现，HCG在HLAG的表达调节上具有重要作用，高表达的HCG可能在绒癌中通过上调HLAG参与免疫逃逸方面具有重要意义。2006年Yie等[8]研究报道了黄体酮、绒毛膜促性腺激素、孕激素可通过上调HLAG的水平以达到保胎的目的，由此推测临床的引产药物如米非司酮等引起流产的机制可能与它们能下调HLAG、HLAE的水平有关，进而推测其在免疫逃逸方面的抗肿瘤机制。

    他们向终末分化，是米非司酮抗肿瘤活性的主要机制;另外米非司酮也可通过下调bcl2、诱导TGFβ1表达从而诱导细胞凋亡[9]；研究还发现米非司酮是一种特异性细胞周期抑制性药物，通过抑制细胞DNA的合成，使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，不能进入S及G2/M期，从而抑制肿瘤细胞的增殖[10]。本研究表明，米非司酮对JEG3细胞具有很强的抑制作用，呈时间和剂量依赖性。高浓度的米非司酮作用于JEG3细胞72h，可以下调HLAG、HLAE基因 mRNA和蛋白水平，而且80μg/ml组下调HLAG、HLAE程度高于40μg/ml组，尤其HLAG表现更明显，提示米非司酮抗肿瘤的另一机制可能是其可以打破机体对肿瘤的免疫耐受，恢复效应细胞的杀瘤作用，从而遏制肿瘤的生长，这也为肿瘤的治疗提供了新的发展方向。尤其对于癌组织高表达HLAG、HLAE的患者或常规药物耐药的患者，在进行肿瘤免疫治疗研究过程中，应该充分考虑肿瘤细胞表达HLAG、HLAE抗原的影响。

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［7］ 陈春玲,廖秦平.HCG促进绒癌细胞系中HLAG的表达［J］.中国妇产科临床杂志,2004,5(2):113 114.

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［10］王刚,郑闻亭,肖平,等.米非司酮对耐药卵巢癌细胞增殖、凋亡及其对顺铂敏感性的影响［J］.癌症,2004,23（4）:406411.