弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl2、bcl6、CD10蛋白表达及其在亚分类中的意义

    作者：陈愉 ,赵彤 ,蔡庆发 ,吴炳绪,陈美燕    作者单位：1. 福建莆田，福州总医院九五临床部病理科；2. 南方医科大学附属南方医院病理科；3.莆田学院附属医院病理科     【摘要】  目的 探讨bcl2、bcl6、CD10在弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma，DLBCL）中的表达及意义。 方法 应用免疫组织化学SP法，检测60例弥漫性大B细胞淋巴瘤标本中bcl2、bcl6、CD10蛋白的表达水平。 结果 bcl2、bcl6、CD10在60例弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达率分别为55.0%(33/60)、48.3%（29/60）、46.7%（28/60），其中CD10（+）/bcl6（+） 15例，25%；CD10（+）/bcl6（-）13例，21.7%； CD10（-）/bcl6（+）14例，23.3%；CD10（-）/bcl6（-）18例，30%。CD10（+）/bcl6（+）与CD10（-）/bcl6（-）中 bcl2的表达差异具有统计学意义。结论 bcl2有望成为DLBCL亚分类的指标。

    【关键词】  bcl2；bcl6；CD10；弥漫性大B细胞淋巴瘤 ；免疫组织化学

    Expression of bcl2，bcl6，CD10 Protein and Their Significance in Subgroups of Diffuse Large Bcell  Lymphoma

    CHEN Yu1, ZHAO Tong2,CAI Qingfa3,  WU Bingxu1,CHEN Meiyan1

    1.Department of Pathology, The  95th Military Hospital, Putian 351100,China;2.Department of Pathology,Nanfang Medical University;3. Department of Pathology,Affiliated Hospital of Putian UniversityAbstract：Objective   To investigate  the expression of bcl2，bcl6，CD10  protein  and their significance in subgroups of diffuse large Bcell lymphoma. Methods  Immunohistochemistry technique (SP method) was used to assess the expression levels of  bcl2，bcl6，CD10 protein  in 60 cases of diffuse large Bcell lymphoma. Results  Expression  of  bcl2，bcl6 and CD10 protein  was found in 33/60(55.0%)，29/60(48.3%)，28/60(46.7%) cases, respectively. The CD10/bcl6 patterns were as follows: CD10（+）/bcl6（+） 15 cases，25%；CD10（+）/bcl6（-）13 cases，21.7%； CD10（-）/bcl6（+）14 cases，23.3%；CD10（-）/bcl6（-）18 cases，30%。Expression levels of the bcl2 protein in  CD10（+）/bcl6（+） pattern was higher than that in CD10（-）/bcl6（-）pattern (P=0.037).Conclusion  The bcl2 protein may be of value to distinct subgroups of diffuse large Bcell lymphoma.

    Key words：bcl2；bcl6；CD10；Diffuse large Bcell lymphoma；Immunohistochemistry

 弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma，DLBCL）是成人最常见的、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤（NonHodgkin's lymphomas，NHL），约占成人NHL的40%[13]，尽管WHO将其列为一种独立的疾病类型，但它实际上是一类异质性的淋巴瘤，应用传统的CHOP（环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松）方案治疗发现仅有一半左右的患者可获得缓解[2]，另一半患者要么治疗无效，要么治疗缓解后复发，最后都导致死亡。对于这一部分的患者，寻找有效的指标来指导治疗是非常重要的。近年来国外一些学者[48]研究发现利用生发中心标志物表达的差异可对DLBCL进行亚分类，另一些学者[912]发现细胞凋亡调控基因在DLBCL分类中也具有重要作用。我们应用免疫组织化学方法检测CD10、bcl6、bcl2在DLBCL中的表达，并对其表达情况及临床意义进行探讨。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    收集本院、莆田学院附属第一医院病理科2003年1月～2006年12月诊断明确病例资料齐全的DLBCL 60例，所有病例均为中性福尔马林固定,常规石蜡切片，HE染色。由两位以上从事淋巴瘤研究的专家重新阅读，按照2001年WHO关于淋巴造血系统肿瘤分类标准重新分类。

    1.2  方法

    采用石蜡切片链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法（SP）免疫组织化学染色，进行生发中心标志物（CD10、bcl6）、凋亡抑制基因bcl2的检测，所用抗体来源、克隆号、工作浓度见表1。免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。抗原修复液为pH9.0的乙二胺四乙酸（EDTA），CD20用0.01mol/L的枸橼酸缓冲液（pH6.0）。用PBS代替一抗作阴性对照，以扁桃体组织作阳性对照。DAB显色，苏木素衬染。CD10/bcl6作为生发中心样分类的依据。

    1.3  结果判定

    阳性结果判断标准： CD20、CD10 阳性定位于细胞膜， bcl6阳性定位于细胞核，bcl2阳性主要位于细胞质，以＞20%的肿瘤细胞染色判为阳性。

    1.4  统计学方法

    采用SPSS10.0统计分析软件进行χ2检验，P<0.05有差异有统计学意义。

    表1  抗体名称、来源及工作浓度

    Tab 1  Immunohistochemical study:

    antibodies and conditions of  use

    AntibodyCloneSourseDilutionCD20L26Maxim1∶20bcl2100/D5Maxim1∶1bcl6P1F6Neomarker1∶1CD1056C6Zymed1∶1

    2  结果

    2.1  临床及病理结果

    60例DLBCL患者，年龄16～91岁，平均年龄52.9岁。男29例，女31例，男女比例为0.94∶1。累及淋巴结27例（45.0%），单纯累及结外33例（55.0%），主要见于胃肠道、中枢神经系统、颌下腺、睾丸等。参照2001年WHO关于淋巴造血系统肿瘤分类标准，组织学变型主要是中心母细胞性，占86.7%，见表2。表2  60例DLBCL组织学变型

    2.2  蛋白的表达

    60例DLBCL中，CD20全部阳性， CD10阳性率46.7% (28/60)， bcl6阳性率48.3% (29/60)，bcl2阳性率55.0% (33/60)。bcl6/CD10模式为：CD10（+）/bcl6（+） 15例，25%；CD10（+）/bcl6（-）13例，21.7%； CD10（-）/bcl6（+）14例，23.3%；CD10（-）/bcl6（-）18例，30%。

    2.3  CD10/bcl6与bcl2表达的相关性

    CD10（+）/bcl6（+）15例中，bcl2（+）3例，阳性率20.0%；CD10（-）/bcl6（-）18例中，bcl2（+）10例，阳性率55.6%。两者的表达差异具有统计学意义（χ2=4.332,P<0.05）。CD10（+）28例中，10例表达bcl2，阳性率57.1%；CD10（-）32例中，17例表达bcl2，阳性率53.1%； 两者bcl2表达差异无统计学意义（χ2=0.097,P>0.05）。bcl6（+）27例中，9例表达bcl2，阳性率33.3%； bcl6（-）33例中，25例表达bcl2，阳性率75.8%；两者bcl2的表达差异有统计学意义（χ2=10.884,P<0.05）。

    3  讨论

    DLBCL是高度侵袭性、异质性的淋巴瘤，在临床表现、形态学特点、免疫表型和遗传学特征等方面都存在明显差异，但若早期诊断、强力化疗，近半数的患者可获得缓解。以往人们常用国际预后指数（IPI）数值的大小判断预后，但临床应用证明大多数DLBCL的IPI数值为中间值[13，14]，难以判断预后。2000年以来国外采用cDNA微阵列技术[47] 研究发现在基因水平上可以将DLBCL分为三种类型：（1）生发中心样（germinal center Bcelllike ，GCB）：基因表达特征与正常生发中心B细胞相似；（2）活化B细胞样(activated  Bcelllike，ABC)：基因表达特征与活化的外周血B细胞相似；（3）第3型（type 3）。并且发现GCB的预后明显好于ABC和type 3，故将DLBCL简单分为两型：GCB与nonGCB ，前者代表预后较好的一型，后者则代表预后较差的一型。但cDNA微阵列技术要求新鲜或冰冻标本以提取足够的RNA, 所使用芯片的价格比较昂贵，临床上难以推广应用。近年来人们把研究的方向转向蛋白水平的表达上，并发现表达CD10、bcl6的患者预后较好。

    CD10，急性淋巴母细胞性白血病共同抗原，为膜相关的中性肽链内切酶；在淋巴细胞的分化过程中，它表达于前B细胞和生发中心B细胞，大约75%的前B淋巴母细胞性白血病及大部分滤泡性淋巴瘤均表达CD10，在基因分析中发现CD10的表达与t(14∶18) 染色体异位有关，因此可以作为生发中心细胞的标志物[15]。本组CD10的阳性率为46.7%（28/60），高于国外的报道[11，16]，可能与本组病例大部分为中心母细胞性有关。

    bcl6，锌指蛋白，为一核内转录因子，属于可调节细胞的增殖、分化及器官的发育、形成的锌指蛋白家族。bcl6基因首先在伴有染色体2q27转位的DLBCL中发现，在成熟B细胞的生发中心内表达，但却未见于不成熟的前体细胞或分化好的浆细胞，它在B细胞的分化和生发中心形成中起重要作用。bcl6基因具有控制炎细胞浸润、淋巴因子表达及生发中心形成的生理作用，可作为一转录因子抑制生发中心B淋巴细胞进一步分化成熟而导致NHL的发生[17]，也可作为生发中心细胞的标志物。研究表明CD10和bcl6联合应用能够确定DLBCL的GCB型，是预后好的有效指标[46，15]。本组bcl6阳性率为48.3%（29/60），与文献报道相近。60例DLBCL中，CD10（+）/bcl6（+） 15例(25%)，低于Bai M(32%)的报道[18]。CD10（-）/bcl6（-）18例(30%)，与Bai M(31%)的报道相近[18]。但CD10（+）/bcl6（-）或CD10（-）/bcl6（+）的病例占38%，对于这一部分的患者，其预后的判断指标仍需进一步探讨。

    大量研究表明细胞凋亡受众多基因调控，bcl2基因是细胞凋亡的重要调节基因，它首先在人体内的B淋巴细胞中发现，是一原癌基因，能抑制细胞凋亡。它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素C等凋亡因子的释放。文献[8,13,19]报道bcl2高表达在DLBCL中较为常见（30%～60%），其中20%～30%病例因bcl2基因易位，即t(14;18)导致bcl2高表达，其余病例因bcl2基因扩增而使bcl2过表达。在DLBCL中，bcl2高表达的患者预后明显差[4，14，20]，并与化疗耐药有关[19]。本组bcl2阳性率为55.7%(33/60)，与国外大部分研究结果相近[8,13]。其中CD10（+）/bcl6（+）15例中，bcl2阳性率为20%，bcl6（-）/CD10（-）18例中，bcl2阳性率为55.6%，两者表达差异具有统计学意义，说明表达生发中心标志物的病例bcl2低表达，而生发中心标志物不表达的病例bcl2高表达，提示bcl6/CD10与bcl2联合应用可能成为DLBCL亚分类的指标。

    本组CD10（+）与CD10（-）的病例，bcl-2表达的差异无统计学意义，但bcl6（+）与 bcl6（-）的病例bcl2表达的差异具有统计学意义，是否提示bcl6（-）的病例可根据bcl2的表达判断预后，bcl6与bcl2的表达是否有一定的相关性，有待进一步研究。

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