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《肿瘤学》

DC活化淋巴细胞对自体乳腺癌细胞的杀伤作用

发表时间:2010-03-27  浏览次数:385次

  作者:张喜梅,周福祥 ,吴建平,徐禹,谢丛华,陈焕朝,周云峰    作者单位:1. 武汉大学中南医院放化疗科,2.肿瘤生物学行为湖北省重点实验室;3.湖北省肿瘤医院   【摘要】  目的 探讨负载自体抗原DC诱导的CTLs对自体乳腺癌细胞的杀伤作用。 方法 以负载自体癌细胞抗原的DCs体外诱导CTLs,用ELISA法检测IFNγ 和 IL12的表达水平,用LDH法检测CTL对自体癌细胞的杀伤作用。结果 负载自体抗原DC组IFNγ 和 IL12的浓度高于未致敏DC组、抗原组及单核细胞对照组(P<0.05),且负载抗原DC组所刺激的CTLs的杀伤作用也强于未致敏DC组、抗原组及单核细胞组(P<0.01)及对照的MCF-7组和HT-29组(P<0.01)。结论 肿瘤裂解物致敏DC可持续刺激特异性 CTLs从而可在体外杀伤乳腺癌患者的自体肿瘤细胞,说明肿瘤抗原致敏的DC疫苗对于治疗残留的和(或)对化疗耐药乳腺癌可能是适合的,因而有可能成为标准的补救措施。

  【关键词】  乳腺癌;树突状细胞;细胞毒性T细胞

  Cytotoxic Effects of CTLs Activated by DCs to Kill Autologous Breast Cancer Cells

  ZHANG  Ximei1,ZHOU Fuxiang1,2,WU Jianping3,XU Yu1,XIE Conghua1,2,CHEN Huanchao3,ZHOU Yunfeng1,2

  1.Department of RadioChemotherapy,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Whuhan 430071,China,2.Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors;3.Hubei Cancer Hospital

  Corresponding Author:ZHOU Fuxiang,Email:happy zhoufx@sina.com;zhou Yunfen,Email:yfzhouwhu@163.comAbstract:Objective   To investigate T cellmediated antitumor effects induced by DCs pulsed with tumor lysates in patients with breast cancer in vitro.Methods  CTLs were activated by DCs pulsed with autologous breast cancer cell lysates.The concentration of IFNγ and IL12 were measured by ELISA.The specific cytolytic activity of CTLs was assessed by LDH assay.Results  The results showed that IFNγ and IL12 were higher in the autologous breast cancer cell lysates pulsed DCs group than those in the unpulsed DCs group,PBMC group and Breast cancer lysate group (P<0.05).The CTLs stimulated by the autologous breast cancer cell lysates pulsed DCs had much higher cytotoxicity to autologous breast cancer cells,as compared with  MCF7 and HT29 cells (P<0.01).Also higher than other three groups just like the level of IFNγ and IL12(P<0.01).Conclusion  The results indicated that tumor lysatespulsed DCs could stimulate specific CTLs and could kill autologous tumor cells in patients with advanced breast cancer in vitro.Autologous tumor antigenpulsed DCbased vaccinations may be appropriate for the treatment of residual and/or chemotherapyresistant breast cancer,and may be as  standard salvage treatment modalities.

  Key words:Breast cancer;Dendritic cell;CTLs

   乳腺癌是世界范围内妇女最常见的肿瘤和第二位致死的癌症,2003年仅美国就有211 300新发病例[1]。虽然外科、放射治疗和化疗能提高患者生存率,但对治疗抗拒的肿瘤细胞早期扩散是转移、复发和死亡的主要原因。生物治疗是近年来发展迅猛的又一重要治疗手段。目前的研究表明,树突状细胞(DC)细胞激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)介导的免疫反应在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用[2]。本研究应用冻融法获取肿瘤全细胞性抗原致敏自体DC,观察其诱导的CTLs对自体乳腺癌细胞的杀伤作用,探讨这一途径对于乳腺癌患者的潜在治疗价值。

  1  材料与方法

  1.1  材料

  对照肿瘤细胞株采用本室培养的乳腺癌细胞株MCF7及结肠癌细胞株HT-29。rh GMCSF 、rh IL4、rh TNF a均购自厦门特宝生物工程股份有限公司。人IL12、IFNγELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。Ficoll Hypaque淋巴细胞分离液购自上海恒信公司。酸脱氢酶测试盒购自南京建成生物工程研究所。

  1.2  方法

  1.2.1  肿瘤抗原的获得

  8例乳腺癌患者,均为女性,病理类型为导管浸润癌,年龄在35~68岁,手术前未接受过化疗和放疗。取其术后标本,经消化处理成单细胞悬液,部分细胞继续培养, 部分细胞以冻融法制备成抗原。

  1.2.2  树突状细胞的培养

  从乳腺癌患者外周血中分离单核细胞(PBMC),培养获得贴壁的DC前体细胞,接种于96孔细胞培养板中,分为a、b、c三组,其中a、b组均加入rhGMCSF 800u/ml,rhIL4 1000u/ml和TNFα 10ng/ml,c组不加任何细胞因子,培养。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50μl/ml。继续培养,第9天消化,分别收集三组细胞并计数。

  1.2.3  细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外诱导

  FicollHypaque密度梯度离心获得乳腺癌患者外周血PBMC,用自制的尼龙毛柱进行分离获取T淋巴细胞,用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中,每孔1ml。分为A、B、C、D四组:前三组分别加入上述收集的a、b、c组细胞(效应细胞与刺激细胞比为40∶1),第四组(D组)加入冻融抗原50μL,每组8个复孔。共同孵育4天后,部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行IFNγ、IL12的检测。

  1.2.4  CTL s对乳腺癌细胞的杀伤作用

  将MCF7、HT29细胞及患者乳腺癌细胞接种于96孔板中,均分为4组,分别加入以上A、B、C、D组CTL(效靶比40∶1),每组3个复孔(8例患者取标本后都重复全部实验),同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照,于培养箱中培养。24h后离心,取上清液100μL于4ml Eppendorf管中,按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。

  1.2.5  IFNγ、IL12的检测

  取上述体外诱导至第6天的CTLs细胞上清液每孔100μL,按晶美公司ELISA检测试剂盒所示方法测定IFN-γ和IL12含量。

  1.2.6  统计学方法

  实验数据用±s表示,应用SPSS13.0统计软件统计分析。组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

  2  结果

  2.1  细胞因子IFNγ和IL12的检测

  乳腺癌肿瘤细胞裂解物致敏后的DC与淋巴细胞一起培养,细胞因子IFNγ和IL12的含量比未致敏DC组、单纯乳腺癌细胞裂解物组和单核细胞对照组高(P<0.05)。表1  细胞因子IFNγ和IL12的检测结果(pg/ml)

  2.2  CTLs杀伤活性的检测

  自体肿瘤抗原致敏DC组诱导的CTLs对靶细胞的杀伤活性优于未致敏DC组及单核细胞组、单纯抗原组CTL的杀伤活性(P<0.01),且其对自体肿瘤细胞的杀伤活性也明显优于对非自体肿瘤细胞(MCF7、 HT29)的杀伤活性(P<0.01),见表2。说明自体肿瘤致敏DC诱导的CTLs杀伤活性具有特异性。表2  不同组CTLs对不同靶细胞的细胞毒活性

  3  讨论

  机体的抗肿瘤免疫反应以局部细胞免疫为主,树突状细胞是机体抗肿瘤免疫的重要免疫活性细胞,目前它在机体抗肿瘤方面的作用正日益受到重视。树突状细胞主要集中于癌周的淋巴细胞密集区,常与淋巴细胞共同存在,同时也散在癌组织中,并且以其突起与癌细胞密切接触。这种分布特点提示树突状细胞以其突起摄取肿瘤相关抗原并识别肿瘤特异性抗原,而后把这种抗原传递给T淋巴细胞,使淋巴细胞浸润在肿瘤旁组织中,从而启动机体的抗肿瘤免疫反应。虽然对于新鲜分离的乳腺癌组织所能提供抗原肽的识别和分布所知甚少,最近的研究毫无疑问地证明已经存在多种肿瘤抗原可被CTL识别而可被用来作为靶分子来诱导体外自体肿瘤细胞杀伤[3]。所以对于肿瘤患者有效的抗肿瘤免疫策略可能是使用未降解的肿瘤衍生的抗原(如全肿瘤细胞、蛋白质或从肿瘤细胞分离出的肽)致敏自体DC。与此观点相符合的是,DCs与乳腺癌细胞融合[4]或以HER-2/neu [5] 衍生的肽致敏自体DCs都能够活化乳腺癌患者的CTL反应。另外DCs细胞疫苗在治疗恶性黑色素瘤[6]、前列腺癌[7,8] 、恶性脑神经胶质瘤等多种肿瘤中取得一些积极的临床实验结果。

  从我们的检测结果可以看出负载肿瘤裂解物的DCs分泌IL12的能力增高了,并且其与CTL分泌 IFNγ的增加呈正相关。这主要是由于IL12可以影响T细胞的极化方向,由于T细胞上调IFNγ表达,通过分泌IFNγ等提高杀伤活性。这些结果表明用IL12、IFNγ的分泌来反应自体肿瘤抗原致敏DC对 CTLs的体外诱导可能是一个有用的方法。本研究中,抗原负载DCs诱导的CTLs对自体乳腺癌细胞在体外有很好的杀伤活性,与未致敏DC组CTLs及未成熟DC诱导的CTLs组(单核细胞组)有明显差异,说明成熟DC能够呈递肿瘤细胞抗原,激发CTLs的细胞毒作用。而非自体肿瘤细胞(MCF7、 HT29)的杀伤活性较差(P<0.01),说明这种用负载自体肿瘤细胞抗原的DC诱导的CTLs细胞毒作用有其特异性。这种良好的特异性杀伤活性表明肿瘤裂解物致敏的DC疫苗刺激的CTLs的免疫治疗可作为乳腺癌患者新治疗手段,但过渡到临床应用仍需体内实验加以证实。

【参考文献】[1] Jemal A,Murray T,Samuels A,et al.Cancer statistic[J].CA Cancer J Clin,2003,53(1): 526.

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[3] Hadden JW.The immunology and immunotherapy of breast cancer: an update[J].Int J Immunopharmacol,2000,21(2): 79101.

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[5] Linehan DC,Goedegebuure PS,Peoples GE,et al.Tumor specific and HLAA2 restricted cytolysis by tumorassociated lymphocytes in human metastatic breast cancer[J].J Immunol,1995,155(9): 44864491.

[6] Ranieri E,Kierstead LS,Zarour H,et al.Dendritic cell/peptide cancer vaccine:clinical responsiveness and epitope spreading[J].Immunol Invest,2000,29(2):121125.

[7] Schellhammer P F,Hershberg R M.Immunogherapy with autologous antigen presenting cells for the treatment of androgen independent prostate cancer[J].World J Urol,2005,23(1):4749.

[8] Barrou B,Benoit G,Ouldkaci M,et al.Vaccination of prostatectonized prostate cancer patients in biochemical relapse,with autologous dendritic cells pulsed with recombinant human PSA[J].Cancer Immunol Immunother,2004,53(5):453460.

 

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