Survivin和Smac在肝外胆管癌中的表达

    作者：李胜棉    作者单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院消化科，2.病理科，3.内镜室     【摘要】  目的 探讨Survivin和Smac在肝外胆管癌发生发展中的作用和意义。方法 27例肝外胆管癌、10例异型增生组织和5例正常上皮组织,均行免疫组化染色检测Survivin和Smac的表达。半定量法结果评价，统计学方法分析比较。结果 Survivin在肝外胆管正常上皮组织、异型增生组织和癌组织中阳性表达率分别为20%、50%和74.1%，正常胆管上皮组织和癌组织中Survivin表达差异有统计学意义（P=0.037）。Smac在肝外胆管正常上皮组织、异型增生组织和癌组织中阳性表达率分别为40%、50%和85.2%，异型增生组织和癌组织中表达差异有统计学意义（P=0.041）。Survivin和Smac的表达与肝外胆管癌组织病理学特征和临床分期无关。结论 Survivin和Smac凋亡相关基因参与了肝外胆管癌的发生发展，可能在由正常上皮组织向异型增生再向癌的恶性转化过程中起重要作用。

    【关键词】  肝外胆管癌 异型增生 Survivin Smac 免疫组织化学

    肝外胆管癌是一种相对少见的疾病，其生长缓慢隐蔽，很难早期发现，往往以梗阻性黄疸为首发症状，手术切除率低，预后很差。肿瘤的发生发展与细胞凋亡密切相关，以往研究表明，在肝外胆管癌发生的癌序列中，凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达逐渐升高[1]。Survivin和Smac是新近发现的凋亡相关基因蛋白,它们在肝外胆管癌及其癌前病变中的表达情况国内外尚未见报道。本研究应用免疫组化染色检测Survivin和 Smac在肝外胆管癌及其异型组织中的表达，探讨它们与肝外胆管癌的发生发展和临床预后的关系。

    1   资料与方法

    1.1   标本的采集

    肝外胆管癌手术切除标本27例，其中高、中分化腺癌24例，未分化腺癌、低分化腺癌3例。临床分期根据1997年国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准分为Ⅰ～ Ⅳ期，其中Ⅰ+Ⅱ期共13例、Ⅲ+Ⅳ期共14例。10例肝外胆管异型增生组织，均取自癌组织边缘。5例正常胆管上皮组织作为对照。所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，进行4μm连续切片10张。标本HE染色后，组织学诊断至少由两名病理医师完成。异型增生组织学诊断依据以下标准：细胞排列紊乱，极性消失，核染色较深，大小不均，核浆比例失调，有轻中度的核异型，偶有分裂象。

    1.2   主要试剂

    Survivin鼠抗人多克隆抗体购自福州迈新生物技术公司。Smac兔抗人多克隆抗体购自Abcam公司。过氧化物酶标记的链霉卵白(SP)染色试剂盒，浓缩型二甲基联苯胺(DAB)试剂均为福州迈新生物技术公司产品。

    1.3   免疫组织化学染色

    采用SP法。具体步骤按试剂盒说明书进行。Survivin和Smac一抗工作液以1∶80和1∶200比例稀释。用已知的Survivin蛋白阳性的肝癌组织和Smac蛋白阳性的心肌组织作为对应的阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗做阴性对照。

    1.4   免疫组化阳性染色指标的判定

    Survivin阳性染色判定参照文献[2，3]的评定标准。Smac阳性染色判定参照文献[4]的评定标准。每张切片观察从阳性染色最强的部位开始，400倍光镜下连续观察5个视野,根据Survivin和Smac阳性细胞所占的百分比分为4个等级：<5%为阴性(-)；6%～ 25%为弱阳性(+)；26%～ 50%为中等阳性(++)；>50%为强阳性(+++)。

    1.5   统计学方法

    利用SPSS10.0统计软件进行统计。阳性率的比较采用确切概率法和卡方检验。相关性检验采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

    2   结果

    2.1   在肝外胆管异型增生组织和癌组织中的表达特征

    Survivin在肝外胆管异型增生组织和癌组织中表达，阳性表达主要表现为胞浆浅黄色或黄色片状或细颗粒状着色，见图 1。

    Smac在正常胆管上皮组织、异型增生上皮组织和癌组织中均有阳性表达，为胞浆黄色或棕黄色片状或颗粒状着色，见图2。

    2.2   在肝外胆管异型增生组织及癌组织中的表达差异比较

    Survivin在三组间表达差异有统计学意义(P=0.049),正常胆管上皮组织和癌组织中Survivin表达差异有统计学意义（P=0.037），正常胆管上皮组织和异型增生组织中Survivin表达差异无统计学意义(P=0.580)，异型增生组织和癌组织中的Survivin表达差异亦无统计学意义(P=0.240)。

    Smac在三组中表达差异有统计学意义(P=0.028)。异型增生组织和癌组织中表达差异有统计学意义（P=0.041），正常上皮组织和异型增生组织中表达差异无统计学意义(P=1.000)，正常上皮组织和癌组织中表达差异亦无统计学意义(P=0.057)，见表1。 表1   正常胆管上皮、异型增生和胆管癌组织中Survivin、Smac表达

    2.3   Survivin和Smac在肝外胆管异型增生组织及癌组织中表达的相关性分析

    在10例异型增生组织中，1例Survivin和Smac同时阳性表达，阳性表达位于几乎相同的组织部位，1例同时阴性表达。等级相关分析显示Survivin和Smac在肝外胆管异型增生组织中表达无相关性（r=0.221,P=0.540）。在27例胆管癌组织中18例Survivin和Smac同时阳性表达, 4例阳性表达位于几乎相同的组织部位。等级相关分析显示Survivin和Smac在肝外胆管癌组织中表达亦无相关性（r=0.167,P=0.406）。

    2.4   肝外胆管癌组织中Survivin和Smac表达与组织病理学特征和临床分期的比较

    Survivin和Smac在肝外胆管高、中分化癌中的表达与低分化癌中的表达差异无统计学意义，在有血管神经浸润有淋巴结转移的肝外胆管癌组织中的表达与无血管神经浸润无淋巴结转移的癌组织中的表达差异无统计学意义，Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期的表达差异亦无统计学意义，见表 2。表2   肝外胆管癌Survivin和Smac表达与临床病理学特征关系

    3   讨论

    Suzuki M等[5]用计算机三维重建方法对12例肝内外胆管癌病人的手术或尸检标本进行肝内外胆管重建分析，发现75%的病例在以癌为中心的周围存在一异型增生带，证实了肝外胆管癌的发生同结肠癌等其他的恶性肿瘤一样也存在从异型增生到癌的癌序列发展过程。本实验27例肝外胆管癌伴发异型增生组织10例，占37.1%，支持肝外胆管癌发生经过癌前病变(异型增生)到癌的病理过程。

    Survivin属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族，正常组织中几乎不表达，而在大多数肿瘤组织中高表达。本研究Survivin在肝外胆管组织，癌旁异型增生组织和正常胆管上皮组织均有表达，在肝外胆管癌组织和癌旁正常胆管上皮组织中表达差异有统计学意义。与常青等[6]的研究结果基本一致。Survivin高表达于肝外胆管癌可部分说明 Survivin通过调节肝外胆管细胞的凋亡参与肝外胆管癌的发生发展。

    Lo Muzio L等[7]研究正常口腔黏膜、无癌变的口腔异常增生病变、发展为癌的口腔异常增生病变和癌组织中Survivin表达分别为0、33%、94%和100%。Kawasaki等[3]应用免疫组织化学方法分析结直肠癌序列中Survivin的表达，发现随着异型增生细胞向癌细胞的转化Survivin基因表达逐渐升高。本研究用SP法检测肝外胆管癌旁正常上皮组织、异型增生组织和癌组织中Survivin阳性表达率分别为20%、50%、74.1%，呈上升趋势，说明在肝外胆管癌的发生过程中，一些致癌因素刺激导致正常组织中Survivin激活，使细胞凋亡抑制，与其他致癌因素共同作用，出现异型增生，进而发生恶性转化。

    Survivin 特异性地高表达于肝外胆管异型增生阶段和癌组织中，可以部分说明Survivin 表达的升高代表着细胞生物学转化的中间环节，代表着正常细胞经过异型增生向恶性转化的细胞生物学行为特征，其阳性表达提示组织学尚正常的组织存在着异型增生的可能，Survivin的过高表达代表细胞发生恶性转变的可能。所以，Survivin表达的升高可能是肝外胆管癌发生的早期事件，它的过高表达代表细胞有发生恶性转变的可能。

    作为Survivin 、XIAP等IAP的拮抗体Smac基因，具有促进细胞凋亡的作用。Smac在人类正常组织中普遍表达，尤其在成人睾丸组织中表达最高，心、肝、肾、脾、前列腺和卵巢中表达次之，脑、肺、胸腺和外周血淋巴细胞中表达低。Smac在肿瘤组织中表达的研究数据不多，在颈部肿瘤中Smac的表达上调[8]，在肾癌组织中Smac的表达下调[9]。Yoo等[10]研究说明Smac表达水平变化由肿瘤的类型决定,可能与肿瘤的异质性有关。本研究结果Smac在正常胆管上皮组织已有较高表达(40%)，在异型增生组织表达稍有升高(50%)，在癌组织则明显升高(85.2%),在正常组织和癌组织中表达差异虽没有统计学意义，但P=0.057，接近0.05，从一定程度上可以说Smac在肝外胆管癌组织上表达与正常肝外胆管上皮中的表达可能存在差异。异型增生组织和癌组织中表达差异有统计学意义（P=0.041＜0.05）。说明Smac参与了肝外胆管癌的发生发展，在异型增生向癌的恶性转化阶段作用更明显。

    Smac在肝外胆管癌中表达上调有三种推测：（1）根据Smac和Survivin相互作用机制和本研究结果Survivin在肝外胆管正常上皮组织、异型增生组织和癌组织中阳性表达率呈逐渐升高的趋势，推测在肝外胆管癌的发生发展过程中，尤其在细胞发生恶性转化阶段，随着Survivin表达的升高，机体通过某种信号转导正反馈引起 Smac mRNA转录增强，翻译产生更多的Smac蛋白来拮抗Survivin的抑凋亡作用[11]。但本研究结果显示Survivin与Smac在肝外胆管异型增生组织中和癌组织中表达均无明显的相关性，可能与样本量少有关。（2）本实验检测到的可能是Smac突变体。突变体失去拮抗Survivin的作用，失去促进细胞凋亡的作用，从而促进了肿瘤的发生发展。（3）Smac可能存在除促进凋亡外的其他作用。总之，Smac参与了肝外胆管癌的发生和发展，其作用机制有待进一步的研究。

    本研究显示Survivin和Smac在肝外胆管癌中的表达与肝外胆管癌的分化程度、有无血管神经浸润、有无淋巴结转移和临床TNM分期无关。Santini D等[12研究发现在壶腹癌中Survivin高表达（83%）与生存预后无关。Ikeguchi等[13]报道了Survivin表达情况可以预测肝癌切除术后患者的预后。本研究结果与文献不一致，可能与本实验的样本量、肿瘤的种类等有关，但基因检测作为新的预测肿瘤发展和预后的方法，越来越被证实。因此Survivin和Smac对肝外胆管癌生物学行为和临床预后的预测意义，需要更多的实验进一步研究。

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