TS及其基因多态性与肿瘤的关系

作者：贺文兴    作者单位：330006 南昌大学研究生院医学部；2 ．江西省肿瘤医院 江西省肿瘤化疗中心     【关键词】  肿瘤化疗 胸苷酸合成酶 TS 因多态性 耐药

    肿瘤具有高度异质性和个体性，肿瘤病变的分子特征决定了肿瘤的恶性特征。基因组学和蛋白质组学作为肿瘤诊疗新平台，是通过对基因多态性及其表达,对肿瘤分子分型而达到个体化诊疗目的。这与我国古代医学提出的同病异治、辨证论治观点基本一致。胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是DNA生物合成反应中的关键酶,其编码基因成为许多化学药物治疗肿瘤的靶基因。通过TS及其基因多态性检测来实现对肿瘤预防、个体化诊疗、预后判断具有重要指导意义。

    1  TS、TS基因多态性和肿瘤基因组不稳定性

    1.1  TS

    TS是由两个相同亚单位组成的二聚体蛋白，相对分子质量为72kDa,是DNA 合成的关键酶， 它催化脱氧尿苷酸（dUMP） 甲基化， 使之转变为脱氧胸苷酸（dTMP） 。TS 在DNA合成与修复、细胞增殖与分化中有十分重要的作用,是肿瘤化疗药5Fu和甲氨蝶呤等重要靶酶。

    1.2  TS基因多态性

    TS基因位于第18号染色体上(18p11.32),长16kb,主要转录起始位点位于ATG起始密码子上游160～180bp，增强子位于起始密码子ATG上游约400bp。基因多态性是指在正常人群中同一基因位点上存在两种或两种以上等位基因，且各等位基因皆具有相当高的频率(频率大于 1%)。现已发现，TS 基因非翻译区(untranslated region,UTR )中存在多态性。多态性可以分为两类，即长度多态性 (length polymorphism) 和位点多态性(site polymorphism)。

    1.2.1  TS基因长度多态性  长度多态性可分为两类：一类为串联重复序列数目不同（variable number of tandem repeats,VNTRS），如小卫星；另一类长度多态性是基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星。

    (1)5′UTR串联重复序列不同数目  启动子是转录过程起始决定部位,对基因表达具有不可缺少调控作用。增强子是增强启动子转录活性的DNA序列。TS增强子区存在28bp串联重复序列多态性，根据VNTRS，分为含有重复2次的为2R、重复3次的为3R，见图1。

    更多重复次数等位基因(4R,5R,9R)出现频率很少。因此,常见的三种基因型为3R/3R、2R/3R、2R/2R。

    (2)TS基因3′UTR 多态性  2000年，Ulrich发现TS mRNA 3′UTR的1494bp处存在一个 6 个碱基缺失/插入多态,形成+6bp/+6bp、+6bp/-6bp、-6bp/-6bp基因型。Ulrich通过95名美国白人检测TS 3′UTR基因型分布，可能由于6bp等位基因频率分布很低而将-6bp等位基因称为变异型等位基因。而事实上英国白人、中国人等不少种族-6bp等位基因型占优势。因此我们认为将-6bp等位基因称作变异型等位基因是不确切的［2］。

    1.2.2  TS基因位点多态性  基因位点多态性是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变、单个碱基的置换(又称单核苷酸多态性,SNP)、缺失和插入。Mandola发现在5′UTR 2R等位基因第一次重复序列和3R等位基因前两次重复序列中均出现USF家族Ebox(CACTTG)。3R等位基因第二次重复序列第12个核苷酸等处存在G→C SNP，见图1 ［1］。因而2R、 3R分别存在2G、2C和3G、3C等位基因型。2R/2R、2R/3G、2R/3C、3G/3G、3G/3C、3C/3C是6 种常见的基因型。SNP是人类基因组中最广泛的多态性现象，是造成个体差异的主要的遗传原因,在目前人类基因组研究中倍受关注。

    1.2.3  TS基因多态分布频率存在种族差异  不同种族人群中TS基因多态分布频率有很大差别。（1）2R,3R等位基因分布频率在土耳其人中为42%

    图1  TS基因5′UTR串联重复序列多态性和单核苷酸多态性［1］

    Fig 1  The TS gene has a variable number of tandem repeats and single nucleotide polymorphism in the 5'untranslated region

    和58%［ 3］，在中国人中分别为18.82%和81.00%，而在非洲人中相同。（2）美国白人TS 3′UTR+6bp等位基因分布频率为71%,中国人华北、华南地区人群分别为32%和30.9%［4］。基因多态分布频率存在种族差异,显示了遗传背景的多样性和复杂性,可能是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现，对维持种群的生存与延续具有重要的生物学意义。

    1.3  肿瘤的基因组不稳定性

    许多肿瘤还以基因组不稳定、等位基因不平衡为特征。杂合缺失（LOH）是等位基因不平衡的常见形式。LOH是指来自父方或母方的一个等位基因的缺失。抑癌基因失活通常是在一个等位基因发生突变后，另一等位基因又发生LOH。Kawakami［5］等通过151例直结肠癌检测5′UTR重复序列基因型，50例杂合子中有31例发现2R、3R等位基因的不平衡,即出现LOH。杂合性缺失(LOH ) 与微卫星不稳定性(MSI)是基因组不稳定性的两个主要表型特征。抑癌基因缺失是许多肿瘤形成的关键步骤之一；复制错误也是不少肿瘤发生过程重要环节，能增加抑癌基因的突变。因而肿瘤组织TS基因分型，还要考虑基因组不稳定性等因素。

    1.4  TS基因多态性与TS表达水平的关系

    TS基因多态性影响了 TS 基因 mRNA 的稳定和翻译效率,导致不同基因型 TS表达效率不同。因此，TS基因多态性是TS表达水平高低及其可能存在亚型的主要影响因素。Morganti等［6］通过48例结直肠癌患者研究显示3R/3R基因型的癌组织TS mRNA表达水平显著高于2R/2R、 2R/3R基因型。Mandola等对结直肠癌患者研究显示TS3’TUR6bp缺失与在体外降低了的TSmRNA稳定性相关，与在体内瘤内较低TS表达相关，可能会提高癌症患风险；这与+6bp等位基因患乳腺癌风险率低的观点一致［4］。

    但也有部分学者认为，TS基因多态性与TS表达水平并不存在相关性。2001年Kawakami［7］发现TS基因5′UTR多态性与TS mRNA的表达水平无关。

    2  TS、TS基因多态性与肿瘤关系

    2.1  TS基因多态性与肿瘤易感性

    2.1.1  TS基因多态性与肿瘤易感性  人群中存在易感个体是由于一些与肿瘤发生相关的基因存在多态性。因此,不少学者认为，TS 基因多态性与患癌症危险性密切相关。Adleff等［8］报道3R等位基因与患结直肠癌风险升高相关，这可能是3R等位基因导致TS表达水平升高，促进细胞过度增殖、逃避衰老和凋亡的缘故。

    2.1.2  TS基因多态性与肿瘤易感因素之间的相互作用  肿瘤的发生、发展受遗传与环境因素共同作用的多因子疾病,基因基因、基因环境交互作用在发病中具有重要影响。(1) 基因基因交互作用。Zhengdong Zhang等研究显示:TSER 2R和 TS3'UTR 6 bp等位基因在中国南方胃癌病因学中可能起到协同作用［9］，存在正交互作用。(2) 基因环境的交互作用。高长明［2］发现，TS6bp／-6bp基因型与吸烟、饮酒、和不饮茶的生活习惯在增加胃癌发生的危险性中有明显的协同作用。（3）叶酸水平影响。人类红细胞叶酸水平<140ng/ml或血浆叶酸水平<3ng/ml会诱发染色体损伤，增加患癌风险。TS5’UTR 2R等位基因携带者，低叶酸摄入患结直肠癌风险显著升高,两者之间存在交互作用［10］。根据TS基因多态性与肿瘤易感性相关性，可以在症状出现以前作出基因诊断，对肿瘤的预测、预防、早期诊断等具有不可估量的价值。

    2.2  TS与肿瘤化疗

    TS表达的调节依赖于细胞周期和细胞增殖状态。在同步细胞中，当细胞从G0期进入到S期，TS活性水平增加约20倍。5Fu是通过抑制TS而发挥其抗癌活性的。5Fu进入体内后,转化为5氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUMP),在辅因子5,10亚甲基四氢叶酸(CH2FH4)的存在下,能和TS结合形成等价的三连复合物TSFdUMPCH2FH4,影响TS与dUMP的结合,抑制了dTMP的合成,使DNA合成受限,达到消灭癌细胞目的。最近ZOU K ［11］等用食管癌细胞株和结肠癌细胞株研究报道,胰岛素能通过提高S期细胞数量、改变三连复合物水平而增强5Fu的抗癌作用。

    不少学者认为，TS水平与化疗疗效间存在负相关。Banerjee等［12］报道以TS cRNA转染肿瘤细胞，使TS高表达，细胞出现对5Fu 和FdUrd耐药。以TS反义RNA转染DLD1细胞，TS表达和活力受到明显抑制，对5Fu敏感性显著增强［13］。TS基因表达水平在4.0×10-3以上的患者对化疗通常均不敏感。以上研究表明,TS水平可预测肿瘤化疗疗效。

    但也有不少学者不同意这种观点。Derenzini等［14］认为化疗很大程度上受到肿瘤细胞动力的影响：对生长迅速的肿瘤效果更好。靶酶TS高表达肿瘤以5Fu为主基础的化疗改善预后更好。关于TS与耐药之间的关系,尽管各自结论有所不同,两者之间相关性还是得到了大多数科学家的认同。部分学者通过TS表达水平与患者改善预后并不具备统计学差异而得出否定结论,忽视了疗效预后受多因素影响的,所以不足以否定TS水平与化疗疗效间相关性。

    在使用TS抑制剂化疗时，肿瘤细胞可出现TS蛋白表达增强，称为TS诱导。TS诱导会导致TS蛋白表达过度、催化活性升高，而导致肿瘤细胞耐药。新型TS抑制剂洛拉曲克在Ⅱ期临床实验中证实其对多种肿瘤具有很好的治疗效果，但在短期运用后会诱导TS表达上调而导致肿瘤细胞对其耐药。李亦蕾［15］等研究认为,降低TS诱导即可降低肿瘤细胞耐药性。

    2.3  TS基因多态性与肿瘤化疗

    遗传药理研究发现，患者对药物的敏感性很大程度上取决于病人的遗传结构组成。基因多态性可引起不同个体在给药时的药理学及毒理学产生不同效果，从而引起药物治疗效果的差异。TS 基因 mRNA 的稳定和翻译效率存在差异,并可导致不同 TS 基因型肿瘤患者对5Fu为基础的化疗疗效不同。因此多数学者认为TS基因型可作为肿瘤治疗疗效的预测指标。Yawata等［16］药敏研究显示：2R/2R和2R/3R组细胞系比3R/3R组对FudR敏感性更高；2R/2R 、2R/3Rc、3Rc /3Rc组（低TS表达组）细胞系对FudR敏感性比3Rg/3Rg组（高TS表达组）更高，表明对5′UTR重复序列基因分型有助于指导个体氟尿嘧啶化疗。高长明等［17］研究发现携带TS6/6bp和6/+6bp基因型患者化疗有效率显著高于+6/+6bp基因型患者。Villafranca F等［18］研究也认为TS重复序列多态性可作为肿瘤降期的预测指标。TS基因多态性的研究有可能为化疗方案制订及预后评估提供了理论依据和指导。

    2.4  TS及其基因多态性预测肿瘤化疗疗效存在局限性

    不少学者认为，TS表达水平和TS基因型检测可以预测肿瘤患者对化疗药物的敏感性和化疗疗效。然而有资料显示，TS的表达与氟脲嘧啶有效性呈负相关的结论并不成立。Lecomte等［19］对90例大肠癌研究表明，5′UTR多态性和3′UTR多态性与5Fu疗效和生存率无关。

    出现这种相反观点，一方面,可能在实验过程中,电泳条件的差异和酶切不完全而产生假阴性,影响 TS 基因型的检测结果,从而导致结论不一致;另一方面,影响肿瘤对5Fu的敏感性有多种因素。除检测了TS,胸苷磷酸化酶(TP)、胸苷激酶(TK)、二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)等与5Fu代谢密切相关的其他酶应该检测而没有检测,因而具有一定的局限性。p53、多药耐药基因和多药耐药相关基因等多种基因也是化疗疗效的影响因素。

    2.5  TS相关耐药逆转

    临床化疗失败重要原因是肿瘤细胞产生耐药性，寻找耐药逆转剂是抗肿瘤药物研究的重要策略之一。目前逆转TS高表达耐药常用的是ECTA方案、5Fu联用甲酰四氢叶酸(LV)或干扰素γ。 ECTA方案使用NB1011等酶催化无毒性试剂。该无毒性试剂经TS的催化才有毒性,所以对TS高表达耐药癌细胞杀伤力强，而对正常细胞杀伤力弱，对TS诱导耐药效果显著,是一种理想逆转剂。联用LV或干扰素γ能降低TS诱导而避免继发性耐药发生。引导肿瘤细胞凋亡是化疗最终途径,5Fu抑制TS,可能通过肿瘤细胞表面Fas受体和Fas配体结合而引导细胞凋亡［20］。这涉及信号传导过程，因而有人提出了免疫治疗方法。

    TS抑制剂化疗时，肿瘤细胞可出现TS诱导而耐药。Ferguson［21］等设计了与TSmRNA3'UTR互补的反义寡核苷酸，使TSmRNA水平被抑制了70%，细胞增殖被抑制40%以上。两者联合治疗可能克服TS上调所致的耐药。Peters等研究表明，高TS活性引导的肿瘤耐药，在合并存在高DPD活性时明显增强；对进展期结肠癌，低TSmRAN／低DPDmRNA者使用5FU和亚叶酸钙，高TSmRNA／高DPDmRNA者使用草酸铂及CPTⅡ，取得良好的临床疗效［22］。

    2.6  基因治疗

    肿瘤的基因疗法特别是自杀基因疗法倍受关注，其原理是将自杀基因导入肿瘤细胞，该基因编码特殊的酶，可将原先无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞自杀。肿瘤自杀基因治疗用于临床，关键是使目的基因在肿瘤细胞中特异性表达，避免导入正常组织细胞中，保证基因治疗安全性。为此，在自杀基因前端接上一个肿瘤特异性的启动子，可以使自杀基因呈肿瘤特异性表达。于波等［23］将TS基因启动子、p16基因启动子重组质粒载体转入耐药HR8348细胞研究结果表明，TS和p16双启动子可引导TK基因靶向性杀伤5Fu耐药肿瘤细胞，保护机体正常细胞，提高自杀基因治疗的安全性。黄慧敏等［24］通过逆转录病毒载体介导的RNA干扰（RNAi)技术，能够间接抑制TSmRNA的表达，为高表达TS的肿瘤基因治疗提供了新的思路和手段。

    2.7  TS、TS基因多态性与肿瘤侵袭性和预后

    不少研究显示，肿瘤TS的表达水平与患者的预后呈负相关， TS的表达可以作为判断癌症患者预后的指标。余之刚等［25］检测164例胃癌标本显示， TS表达水平高低与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移与否及临床病理分期密切相关。TS高表达预示着肿瘤具有较强的侵袭性，TS基因产物低表达患者的局部复发率和远处转移率均明显低于高表达患者。它在DNA合成中发挥作用,过度表达TS肿瘤细胞群可能具有优势潜能，高TS表达与不良预后相关可能是细胞增生状态的反映。也有学者研究得出不同结论，董稚明等［26］通过51例食管癌标本TS表达检测结果表明，TS表达水平与患者淋巴结转移和临床病理分期无关。

    肿瘤病变的分子特征决定了肿瘤的恶性特征、转移特征、复发特征，是肿瘤的预后判断的基本依据。董稚明等［26］研究提示，TS 5'UTR多态性分析可能作为预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移能力的分子指标。可见人群基因型可能与肿瘤分级、分期有关，对预测肿瘤预后有一定意义；对肿瘤进行分子分型,可能会使医生对病情和发展趋势的预后判断更细致、更正确，对疗效监控情况更清晰。

    3  结束语与展望

    化疗在肿瘤综合治疗中有着重要的价值，耐药仍是肿瘤化疗一大难题。不同学者报道结论有所不同，这可能由于随着研究人群、年龄、地域、观察终点和方法不同而有所差异。组织大样本随机对照研究，系统评估,进一步研究TS及其基因多态性与肿瘤关系,将有助揭开肿瘤细胞耐药的机制。根据TS、TS基因型检测指导个体化疗，可提高用药针对性和有效性，减少用药的盲目性及其毒副作用。不少学者认为，TS及其基因型检测有望成为预测肿瘤发生、化疗疗效评估、预后判断的指标，将为肿瘤防治带来美好前景。未来个体化医学，相信会建立在循证医学基础上，以基因组学和蛋白质组学为依托的个体化肿瘤综合诊疗模式。但目前国内外对TS基因3′UTR 多态性、SNP和肿瘤的基因组不稳定性报道不多,对TS相关耐药的逆转和有关TS基因治疗研究甚少，有待进一步研究。

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