唑来膦酸对软骨肉瘤细胞生长的影响

作者：郑伟 郭开今 张子阳 韩会峰 储朝明 郭伟华 徐 波 赵德勇作者单位：徐州医学院附属医院骨科（江苏）  【摘要】  目的 研究探讨第三代双磷酸盐类药物唑来膦酸(ZOL)在体外对人软骨肉瘤细胞株SW1353增殖及凋亡的影响,进一步研究ZOL与甲氨喋呤（MTX）对细胞的生长抑制是否具有协同作用。方法 应用细胞计数、形态学观察、流式细胞术等方法，检测和观察分别及联合应用不同浓度ZOL和MTX对SW1353的增殖抑制和诱导凋亡的作用。结果 ZOL对SW1353细胞的抑制效应与药物剂量及作用时间均呈正相关；与MTX联合用药，作用明显强于单独用药组，抑制率59.22％(P<0.05)，凋亡率28.47％(P<0.05)。结论 ZOL对软骨肉瘤SW1353细胞株有生长抑制作用,呈时间、剂量依赖性效应,与MTX联合用药抑制作用更强，有协同作用。 【关键词】  SW1353细胞系 双磷酸盐 唑来膦酸 MTX 凋亡    软骨肉瘤（Chondrosarcoma）是一种软骨基质产生的恶性肿瘤，是常见的原发恶性骨肿瘤之一，致死率在10％～50％，目前尚无有效的药物治疗，因此开发更新、更加有效的化疗药物是提高软骨肉瘤治疗效果的当务之急。    双磷酸盐是一类强有力的骨吸收抑制剂,被广泛的应用于治疗骨质疏松症和恶性肿瘤引起的高钙血症和骨痛症等［1］。除了强大的抗骨吸收功能外,双磷酸盐抗肿瘤作用受到越来越多的重视［2-4］。近年国外研究发现,双磷酸盐药物在治疗骨破坏的同时可抑制多种恶性肿瘤细胞系的增殖［5-6］。但对软骨肉瘤的治疗研究文献报道较少。为了探索软骨肉瘤治疗的新途径, 本研究采用最新一代的双磷酸盐ZOL作用于软骨肉瘤SW1353细胞株,观察其对细胞的增殖、凋亡等生物学效应,对其引发肉瘤细胞损伤的可能机制进行了分析,并联合化疗药MTX,观察ZOL与MTX的协同作用,为ZOL抗软骨肉瘤的临床治疗提供理论依据。　　1  材料和方法　　1.1  细胞及培养条件 　　人软骨肉瘤细胞SW1353，徐州医学院附属医院骨科韩会峰赠送。接种于含10%胎牛血清、DMEM培养基中,在 37 ℃含5%CO2的培养箱中培养。细胞贴壁生长，每3天用0.25%的胰酶消化,进行传代培养。24 h后加ZOL和MTX至所需浓度，每24 h换液一次,并为相应浓度的药物设立对照组。　　1.2  药物和试剂 　　ZOL注射液购自济南正大生化药品有限公司，MTX购自济南双全化工有限公司，噻唑蓝(MTT)、碘化丙锭(PI)均购自美国Sigma公司，ELX800酶标仪(BIO-Tekinstruments,美国)和流式细胞仪(Bdfacs,美国)。

　　1.3  细胞形态观察

　　细胞经药物处理后，继续培养24、48、72 h，在倒置相差显微镜下观察。

　　1.4  MTT法检测

　　用含10％胎小牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔400个细胞接种到96孔板，每孔200 μl，贴壁后加不同浓度ZOL、MTX及联合组处理，每种浓度平行3孔，并设立空白对照组。培养箱内分别培养24、48、72 h,每孔加MTT液（5 mg/ml）20 μl，空白调零组加入20 μl生理盐水，继续培养4 h弃上清后加150 μl DMSO溶解，将培养板置于振荡器上振荡10min至完全溶解，用全自动荧光酶标仪在490 nm波长测定吸光度A,计算细胞生长抑制率:抑制率= (1-实验孔测定值/对照孔测定值) ×100%。

　　1.5  流式细胞术检测细胞凋亡率

　　取对数生长期的SW1353细胞,收集（1～5）×106/ml细胞,设对照组、ZOL (1、10 μmol/L)单药组及ZOL(1、10 μmol/L)+MTX(100 nmol/L)联合用药组。每组均重复3瓶。继续培养72后收集所有细胞,1 000 r/min离心5 min,弃去培养液，PBS 1 ml洗2次，离心，加入冰预冷的70%乙醇固定，4 ℃过夜；离心弃去固定液,加入PI 染液1 ml,于4 ℃避光染色30 min,400目尼龙网过滤，上流式细胞仪检测凋亡率。

　1.6  统计学处理

　　计量资料用（x±s）表示，应用SPSS 11.5统计软件，采用单因素方差分析及多个样本均数间的两两比较分析。

　　2  结果

　　2.1  ZOL对软骨肉瘤SW1353细胞系生长的抑制作用

　　在倒置显微镜下,空白组细胞呈梭形、纺锤形,核呈圆形,贴壁生长良好、密集;ZOL(1、10 μmol/L)处理72 h的SW1353细胞，部分细胞变得不规则,梭形不明显，有的细胞皱缩;ZOL 50 μmol/L处理的SW1353细胞梭形消失,表现出不同程度的细胞皱缩,边缘毛糙,部分细胞核染色质固缩,聚集于核边,胞浆浓缩,部分可出现凋亡小体；ZOL 100 μmol/L以上处理的SW1353细胞多数呈圆形,脱落而悬浮于培养液中，只剩少数细胞贴壁。以上改变随着药物浓度及作用时间的延长而愈趋显著。ZOL浓度超过150 μmol/L以上时,90%以上的细胞生长被抑制,因此,未再进一步延长作用时间及增加药物浓度对细胞生长进行研究。ZOL对SW 1353细胞作用72 h的IC值为26 μmol/L。见图1。

    表明:1)细胞存活率与药物浓度呈负相关,且有明显的剂量依赖性。2)随着时间的延长,药物的敏感性增加,同一剂量的药物有时间依赖关系。

　　2.2  ZOL对软骨肉瘤SW 1353细胞的诱导凋亡作用

　　流式细胞仪定量检测细胞凋亡比例，结果见表1。B、C、D组分别与A组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；B、C组与D组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；C组与B组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。表1  流式细胞检测药物对SW1353细胞凋亡的影响（略）注：*P＜0.01，vs Control group;#P＜0.01，vs ZOL+MTX group。

　　2.3  ZOL与MTX的协同作用

　　单药ZOL组浓度为1、10 μmol/L时,SW 1353细胞凋亡率分别为(10.49±1.52)%、(16.83±0.54)%,单用MTX (100 nmol/L)时细胞凋亡率为(7.83±1.26)%；当ZOL(1、10 μmol/L)联合MTX(100 nmol/L)时,SW 1353细胞的凋亡率分别为 (17.22±1.68)%、(28.47±3.54)%,联合用药组的凋亡率明显高于单药组(P<0.01)。联合用药对SW 1353细胞生长抑制情况见表2。表2  ZOL联合MTX对SW1353生长的抑制情况（略）注：与单药组比较，*P＜0.05。

　　3  讨论

    双磷酸盐能有效地抑制破骨细胞介导的骨重吸收作用。含氮的双磷酸盐能作用于对维持细胞膜稳定性有重要作用的甲羟戊酸,使破骨细胞被吞噬［7］。另外,双磷酸盐能吸附在骨小梁的表面,形成一层保护膜，选择性抑制破骨细胞的骨溶解作用,与骨小梁结合后可以阻止肿瘤细胞与骨质的结合,从而可能阻止恶性肿瘤骨转移的发生［8］。已有研究发现双磷酸盐有直接抗肿瘤作用,国外的体外实验表明双磷酸盐类药物能抑制多种恶性肿瘤细胞系的生长［5-6］,大量临床研究已经证明ZOL在改善癌症骨转移引起的并发症如顽固性疼痛、病理性骨折、脊髓压迫、高钙血症方面起到了较好的作用,提高了生存质量［9］。本实验采用ZOL及MTX作用软骨肉瘤SW1353细胞系,通过MTT法、电镜及流式细胞技术等方法,对两种药物抑制细胞生长及促进调亡效应进行了检测。MTT法证实了ZOL对软骨肉瘤SW1353细胞增殖有抑制作用,且这种抑制效应与药物浓度、作用时间呈正相关；ZOL与MTX联合应用,对SW1353细胞的生长抑制效应明显强于单独用药,电镜下观察到经ZOL处理的SW1353细胞具有体积缩小、细胞膜皱缩、核凝聚变小、染色质浓集等典型的凋亡形态学的改变,流式细胞仪定量检测证实了凋亡的发生,并且联合用药组诱导的细胞凋亡率明显高于单药组,表明ZOL对软骨肉瘤SW1353细胞有增殖抑制和促凋亡的作用，而且ZOL与MTX有协同作用。本研究证实双磷酸盐类药物可通过诱导凋亡,从而达到抑制软骨肉瘤细胞的生长，为ZOL联合MTX在临床应用提供了一定的理论依据，同时双磷酸盐类药物用药量少、用药时间短、毒副作用小、无骨髓抑制、患者对其耐受性好，故在肿瘤治疗中占有越来越重要的地位。

【参考文献】  　　［1］Rodan GA, Martin TJ. Therapeutic approaches to bone diseases［J］. Science, 2000,289(5484):1 508-1 514

　　［2］Woodward JK, Neville-Webbe HL, Coleman RE, et al. Combined effects of zoledronic acid and doxorubicin on breast cancer cell invasion in vitro［J］. Anticancer Drugs,2005,16(8):845-854

　　［3］Dumon JC, Journe F, Kheddoumi N, et al. Cytostatic and apoptotic effects of bisphosphonates on prostate cancer cells［J］. Eur Urol,2004,45(4):521-529

　　［4］Gouin F, Ory B, Redini F, et al. Zoledronic acid slows down rat primary chondrosarcoma development, recurrent tumor progression after intralesional curretage and increases overall survival［J］. Int J Cancer,2006,119(5):980-984

　　［5］Margaret VL, Eva MF, Frederick RS, et al. Bisphosphonate treatment inhibits the growth of prostate cancer cells［J］. Cancer Res, 2001,61:2 602

　　［6］Jagdev SP, Coleman RE, Shipman CM, et al. The bisphosphonate, zoledronic acid, induces apoptosis of breast cancer cells: evidence for synergy with paclitaxel［J］. Br J Cancer,2001,84:1 126

　　［7］Bruce EH, James NI, James TB, et al.American society Of clinical oncology guideline on the role of bisphosphonates in breast cancer［J］. J Clin Oncol,2000,18:1 378　　　　［8］Rogers M J, Gordon S, Benford HL, et al.Cellular and Molecular mechanisms of action of bisphosphonates［J］. Cancer,2000,88:2 961-2 978

　　［9］Cameron D. Proven efficacy of zoledron acid in the treatment of bone metastases in patients with breast cancer and other malignancies［J］. Breast,2003,12 Suppl 2:S22-S29