Beclin1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

作者：刘全    作者单位：430022 武汉， 华中科技大学附属协和医院胸外科 　　【摘要】  目的 检测人非小细胞肺癌标本中自噬相关基因Beclin1的表达并讨论其意义及与细胞病理类型和临床分期的关系。 方法 采用免疫荧光染色、RTPCR和Western blot法检测54例非小细胞肺癌的肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织Beclin1蛋白、mRNA表达。结果 免疫荧光染色显示Beclin在肺癌组织中表达较低，表达率为8.3%，显著低于癌旁和正常组织(P=0.00)。Beclin1 mRNA在肺癌、癌旁及正常组织中的相对表达量为1.302±0.074、1.691±0.100、1.673±0.081(F=6.6, P=0.002)，Western blot检测Beclin1蛋白在肺癌、癌旁、正常组织中的相对表达量分别为3.489±0.293、5.306±0.459、6.329±0.580（F＝9.73，P<0.01）。Beclin1蛋白和mRNA表达与肺癌病理组织类型和临床分期无明显关系。结论 Beclin1蛋白和mRNA表达在肺癌组织中明显低于癌旁和正常组织，表达量的差异有统计学意义，在癌旁和正常肺组织中表达接近。

　　【关键词】  自噬 Beclin1 非小细胞肺癌

　　肺癌是发病率较高的恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，抑癌基因的失活、细胞内异常物质和内环境的改变、受损细胞器清除障碍、癌细胞凋亡受阻等因素都可能起到重要作用，这些过程都有自噬参与。Beclin1是一种与自噬密切相关的抑癌基因，编码自噬相关蛋白。Beclin1在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中表达均有缺失[1]，在蛋白和mRNA表达水平研究自噬在肺癌中的表达目前鲜见报道。本研究检验了自噬相关基因Beclin1在肺癌、癌旁组织、正常肺组织临床标本中的表达情况，并探讨其与肺癌的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象和标本采集

　　选择2006年4月～2006年10月手术切除的非小细胞肺癌标本54例，所有病例经病理学确诊,术前均未接受放、化疗。每例标本取肺癌组织及相应的近癌旁组织(距肿瘤边缘1～3cm)、正常组织(距肿瘤边缘> 5cm)各一个样本。54例患者中男39例,女15例。年龄37～75岁,平均（56.3±8.1）岁。肿瘤组织病理类型均为非小细胞肺癌，其中：腺癌32例，鳞癌17例，大细胞癌3例，腺鳞癌2例。依据1997 年UICC TNM 分期: Ⅰ期11 例, Ⅱ期27例, Ⅲa期16例。所取组织标本手术切除后立即用生理盐水洗净血污后装EP管置液氮罐保存备用。

　　１．２  主要试剂

　　Beclin1一抗购于美国santa cruse公司，逆转录PCR试剂盒(TakaRa公司)和 RNA试剂盒（包括了Taq酶）购置北京赛百盛基因技术有限公司,Beclin1引物由上海生工生物技术有限公司合成。

　　１.３  免疫荧光染色

　　取各组肺癌组织，冰冻切片（厚度0.1mm），1/2丙酮+1/2酒精固定5min，0.3％ Triton破膜，加入Beclin1一抗4℃过夜（1∶200），以PBS 代替一抗作为空白对照，阴性抗体作为阴性对照。PBS漂洗后加兔抗羊IgG FICT荧光二抗(1∶100)，避光37℃ 0.5h。激光共聚焦显微镜下波长为353.6nm观察拍照。

　　１.４  RT－PCR方法

　　RTPCR方法：每份冻存标本取1mm3剪碎研磨,加入1ml Trizol溶液裂解,按Trizol试剂盒说明书采用一步法提取总RNA,以DNA/RNA测定仪测定RNA的纯度和浓度。按逆转录合成试剂盒说明合成cDNA，待用。GAPDH作为内参照，目的片段为452bp,引物序列：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′(上游), 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′（下游）。Beclin 1: 5′ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG3′ (上游)， 5′GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG3′ （下游）, 363bp；MAPLC3: 5′GAAGATGTCCGACTTATTCGAGAG3′(上游)5′ACTCTCATACACCTCTGAGATTGG3′（下游）,    352bp。PCR条件：94℃ 1min, 55℃ 1.5min， 72 ℃  0.5min，共30个循环。结果用Quanlityone分析，以阳性条带与GAPDH光密度比值作为阳性条带的相对表达值，SPSS11.5统计学分析。

　　1.5  Western blot检测

　　RIPA buffer  200μl裂解细胞, 考马斯亮蓝法蛋白定量,  常规电泳、 转印和封闭后,  加入Beclin1(1∶100)4℃孵育过夜;  抗人碱性磷酸酶标记二抗(1∶3000,  北京中杉金桥生物技术有限公司),  室温孵育2h,  碱性磷酸酶染色5min,  胶片曝光显影， 结果用Quanlityone分析， βactin为内对照， 以阳性条带与内对照光密度比值作为阳性条带的相对表达值。

　　１.６  统计学方法

　　采用SPSS11.5作统计学分析。

　　2  结果

　　2.1  免疫荧光结果

　　免疫荧光染色显示正常组织和癌旁组织均有Beclin1表达（表达率100％），见图1a～c，Beclin1在49例肺癌标本中不表达（90.7%）。不表达的癌细胞呈空泡状未染色状态，见图1d～f。Beclin1在肺癌和非癌组织中的表达差异有统计学意义（χ2=60.9, P=0.00）。

　　2.2  RTPCR检测结果

　　Beclin1 mRNA表达出现在所有组织中。GAPDH mRNA半定量后Beclin1 mRNA在肺癌、癌旁、正常组织的相对表达量分别为1.302±0.074、1.691±0.100、1.673±0.081(F=6.6, P=0.002)。Beclin1在肺癌组织和其他组织中表达量差异有统计学意义, 在癌旁组织和正常组织中的相对表达量差异无统计学意义， Beclin1 mRNA在癌旁组织和正常组织中的表达量均强于肺癌组织，见图2。

　　图1  Beclin1在肺癌组织未表达（箭头所示）呈空泡状,正常组织表达良好

　　图２  Beclin1 mRNA在正常组织、癌旁组织、肺癌组织的表达

　　２．３  Western blot检测结果

　　肺癌组织中的Beclin1蛋白低表达（肺癌组织：3.489±1.760；癌旁组织：5.306±2.755；正常组织：6.329±3.483），癌旁或正常组织中高表达（F＝9.73，P<0.001），相对表达量差异有统计学意义（P＝0.000）（图３）。

　　图3  Beclin1蛋白在正常组织、癌旁组织、肺癌组织的表达

　　２.４  Beclin1在不同病理类型和临床分期中表达

　　在本研究中，NSCLC的不同细胞病理类型以及临床分期之间，Beclin1的mRNA表达以及蛋白表达差异无统计学意义，见表１。

　　3  讨论

　　Ｂeclin１位于人类染色体17q21上,大约有150kb，被认为是一种双等位抑癌基因（haploinsufficient tumor suppressor），其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一[2]。据报道75%的人类卵巢癌[3,4]、50%乳腺癌[5]和40%前列腺癌[6]细胞存在Beclin1单等位基因缺失突变,其表达量不同程度下降[7]。恶性肿瘤中Beclin1的双等位基因突变则较为罕见。关于肺癌的Beclin1基因突变少见报道。本研究发现Beclin1蛋白在正常肺组织中表达的相对量显著高于肺癌样本，和癌旁组织差异无统计学意义；肺癌组织的免疫组化染色普遍呈阴性，照片显示和正常组织形成鲜明对比的空泡状无染色区； RTPCR 结果也提示肺癌组织Beclin1基因转录的减少。同时我们也观察到，Beclin1的表达情况与肺癌的病理组织类型和临床分期没有明显的相关性，尚难对其与癌细胞生物学特性的关联作出推断。

　　Beclin1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，主要通过调节自噬水平而对肿瘤的发生、发展起着重要作用[2]。自噬现象是一种高度保守的细胞行为，几乎存在于所有的物种，构成了从简单的单细胞生物、植物到哺乳动物细胞中广泛存在着的降解/再循环系统的重要组成部分[7]，并且是完整细胞器和大分子蛋白降解的主要途径[8]。自噬的失调和肿瘤的发生、发展、转归关系密切[9，10]。Beclin1通过调节自噬水平参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除，并维护细胞内环境稳态[11]，自噬体的形成与ATG(AuTophaGyrelated gene)系列基因有关，Ｂeclin１是酵母ATG6的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，Ｂeclin1基因主要与Ⅲ型PI3K(phosphatidylinositol 3kinase)形成复合体来调节其他的ATG蛋白在自噬前体结构中定位，来调节自噬活性[12]。已经证实上调Beclin1在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生[13]。

　　和传统的抑癌基因不同， Beclin1基因是一类新的抑癌基因， 只有在双等位染色体都表达时才能够发挥抑癌作用。 Beclin1等位基因敲除的小鼠发生自发性恶性变（包括乳腺肿瘤、肺癌、肝癌等）几率增加，且易受HBV诱导的前恶变性损伤。Beclin1蛋白在人类乳腺癌中表达较正常乳腺细胞低，将表1  不同病理类型和临床分期肺癌组织的Beclin1  mRNA和蛋白表达Beclin1转染人乳腺癌细胞株MCF7 后抑制MCF7细胞在体外增殖,并降低MCF7细胞的成瘤性[13],这些发现都提示了Beclin1的抑制肿瘤作用。Beclin1基因还和一些肿瘤相关信号传导通道关系密切， 例如： PTEN通道[14]和 Rb信号传导通道[15，16]都与Beclin1不同程度相关。Beclin1也能够协同其他药物的抗肿瘤作用，上调Beclin1的表达能够增强顺铂诱导的胃癌细胞系MKN28凋亡，抑制Beclin1则削弱了顺铂的细胞毒作用[17]。

　　关于Beclin1对于肺癌的早期诊断和预防的价值，调控Beclin1的表达对于不同时期肺癌细胞发展的影响，以及协同其它抗肿瘤手段对于肺癌的治疗效果，目前仍然缺少相关资料。进一步的研究将对阐明肺癌的发生、发展机制并为最终开发新的治疗手段提供理论依据。

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