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《肿瘤学》

全反式维甲酸对荷瘤Wistar大鼠生存期的 影响及其机制

发表时间:2010-03-06  浏览次数:540次

作者:付锐    作者单位:442000 湖北十堰,郧阳医学院附属太和医院神经外科   【摘要】  目的 研究全反式维甲酸对荷瘤鼠生存期的影响及其机制。方法 建立wistar大鼠脑内C6胶质瘤模型,待肿瘤生长至第7天,随机将荷瘤鼠分为维甲酸治疗组和对照组。于接种后的第22天,免疫组化检测各组P27Kip1蛋白的表达并观察动物生存期。结果 与对照组相比,治疗组动物p27kip1蛋白的表达增高(P<0.05),生存期延长(P<0.05),两者呈正相关。结论 全反式维甲酸延长动物生存期的机制同上调p27kip1蛋白的表达有关。p27kip1蛋白的表达高低可作为判断胶质瘤预后的指标。

  【关键词】  胶质瘤 全反式维甲酸 p27kip1 生存期

  全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的成功,展现了其治疗肿瘤的良好前景。近年来,国内外学者已开始探讨该疗法在胶质瘤治疗中的潜在用途,但多限于离体细胞或者皮下模型实验。本实验通过对脑内接种有C6胶质瘤的wistar大鼠实施全反式维甲酸治疗,观察生存期并探讨其机制,以便为临床应用提供新的理论依据。

  1  材料与方法

  1.1  细胞培养

  1.1.1  细胞来源  C6细胞是一种经N亚硝基甲脲诱发的高度恶性的大鼠脑胶质瘤(购于中科院上海细胞所)。

  1.1.2  培养方法  C6细胞在含有10%的新生小牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM培养基中,5%CO2、37℃条件下培养。

  1.2  动物模型建立

  1.2.1  动物  健康Wistar大鼠,雌雄不限,鼠龄4~6周,体重150~200g,常规喂养,共40只。

  1.2.2  方法  Wistar大鼠经10%的水合氯醛3ml/kg麻醉后,固定于立体定向仪上,于大鼠右顶叶皮质S1区(前囟后1mm,矢状缝旁3mm)接种C6胶质瘤细胞1×106/10μl,微量注射器注入[1]。

  1.3  动物分组及治疗的实施

  接种C6细胞后第7天,将荷瘤鼠随机分为对照组和维甲酸治疗组,每组20只。对照组:无水乙醇和磷酸盐缓冲液按1∶9配制,每天1ml腹腔注射,连续2周。全反式维甲酸治疗组:无水乙醇和磷酸盐缓冲液按1∶9配制后,加入全反式维甲酸(购自美国sigma公司),浓度为1mg/ml,每天1ml腹腔注射,连续2周[2]。

  1.4  免疫组化检测p27Kip1蛋白的表达

  接种C6细胞后第22天,每组随机取10只大鼠,经10%的水合氯醛3ml/Kg麻醉后,经左心室插管,剪开右心耳,300ml生理盐水快速冲洗后,以4%多聚甲醛(4℃,pH值7.4)300ml灌注固定,先快后慢。此后开颅取出瘤块于4%多聚甲醛中进一步浸泡固定72h,常规石蜡包埋。每个蜡块厚4μm行连续切片,每20张取1张,裱于玻片上凉干备用。将石蜡切片常规脱蜡至水,用单克隆鼠抗p27Kip1(美国Santa Cruz公司),工作浓度1∶100,采用免疫组化法(SP法)进行检测,步骤参考试剂盒说明书操作。用已知的阳性切片作阳性对照,以0.01mmol PBS代替一抗作阴性对照。在400倍镜下,每3张切片计数单位视野阳性细胞占细胞总数百分比,至少计数1 000个肿瘤细胞,阳性细胞所占比率为蛋白表达百分比。

  1.5  观察动物生存期

  直接记录动物生存时间,绘制生存率曲线。

  1.6  统计学方法

  采用SPSS10.0统计分析软件,p27Kip1蛋白的表达采用t检验比较其差异。各组大鼠生存期用KM乘积极限法及时序检验分析。用Spearson相关分析法对p27Kip1蛋白阳性表达率和生存期进行相关性分析。

  2  结果

  2.1  p27kip1蛋白免疫组化检测

  p27Kip1蛋白表达位于肿瘤细胞核内、阳性细胞呈棕黄色,图1略。对照组及治疗组p27Kip1蛋白表达阳性细胞百分数分别为(4.81±0.72)%、(17.05±1.88)%(P<0.05)。

  2.2  对照组及治疗组动物中位生存期分别为(37.00±1.55)天、(46.00±1.58)天(P<0.05)。生存率曲线,见图2。

  图2  各组动物生存率曲线

  2.3  经Spearson相关分析表明p27Kip1蛋白阳性表达率和生存期呈正相关(r=0.596,P<0.05)。

  3  讨论

  全反式维甲酸作为一种脂溶性化合物,可通过血脑屏障,并在脑组织内浓集,这是其应用于胶质瘤治疗的基础。本实验通过检测p27kip1蛋白的表达结果显示,维甲酸治疗组p27kip1蛋白的表达明显高于对照组,两者差异有统计学意义。研究表明维甲酸引起p27Kip1蛋白水平的增加与以下多种因素有关:降低细胞内泛素蛋白酶系统中相关蛋白质的表达和(或)活性[3],保持p27Kip1蛋白低磷酸化状态[4]。我们推测维甲酸引起大鼠C6脑胶质瘤p27Kip1蛋白水平的增加也与此有关。目前的研究认为p27Kip1蛋白可以和细胞周期素及CDK广泛结合,抑制G1期相关的cyclinDCDK4、cyclinECDK2等的活性,对细胞周期起负性调节作用,从而抑制细胞增殖。这在以下正反两实验中可得到证实:p27Kip1缺乏的小鼠同正常小鼠相比,许多器官细胞数目增多,从而体积增大 [5];而在体外培养的恶性肿瘤细胞系中转染,p27Kip1蛋白过表达导致细胞增殖抑制[6]。本研究前期实验[7]已证实维甲酸治疗可缩小肿瘤体积,我们推断这也同维甲酸上调p27Kip1蛋白的表达有关。众所周知,瘤体的缩小是提高生存期的重要因素,因此我们认为全反式维甲酸治疗延长荷瘤鼠生存期的机制在于上调p27Kip1蛋白的表达,抑制细胞增殖,缩小肿瘤体积。本研究还表明p27Kkip1蛋白的表达同生存期呈正相关,因此认为p27Kip1蛋白的表达高低可作为判断预后的指标。 

  【参考文献】  [1] 黄宽明,涂汉军,李新建,等.大鼠皮层C6脑胶质瘤模型的建立[J].肿瘤防治杂志,2003,10(5):449451.

  [2] Gerald E,Keith L. Trans retinoic acid inhibits in vivo tumour growth of C6 glioma in rats:Effect negatively influenced by nerve growth factor[J].Neurological Researrch,1994,16(6):184186.

  [3] Zancai P, DalCol J,Piccinin S,et al.Retinoic acid stabilizes p27(Kip1) in EBVimm ortalized lymphoblastoid B celllines through enhanced proteasomedependent degradation of the p45(Skp2) and Cks1 proteins[J].Oncogene, 2005,24(15): 24832494.

  [4] Nakamura M, Matsuo T, Stauffer J,et al.Retinoic acid decreases targeting of p27 for degradation via an Nmycdependent decrease in p27 phosphorylation and an Nmycindependent decrease in Skp2[J]. Cell Death Differ,2003,10(2):230239.

  [5] Nakayama K,Ishida N,Shirama M,et al.Mice lacking p27kipl display increased body size,multiple orgen hyperplasia,retinal dysplasia,and pituitary tumors[J]. Cell, 1996, 85(5):707720.

  [6] Chen J,Willingham T,Shuford M,et al.Tumor suppression and inhibition of aneuploid cell accumulation in human brain tumor cells by ectopic over expression of the cyclindependent kinase inhibitor p27[J].J Clin Invest,1996, 97(8):19831988.

  [7] 付锐,王伦长,涂汉军,等.全反式维甲酸诱导分化大鼠C6脑胶质瘤的实验研究[J].肿瘤防治研究,2005,32(2):7375.

 

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