高表达ΔNp73基因对大肠癌细胞生物学行为的影响及其机制研究

作者：吴红涛 麻晓林    作者单位：400038 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心     【摘要】  目的 通过增强肿瘤细胞中外源性ΔNp73基因的表达, 探讨该基因对大肠癌细胞生物学行为的影响。方法 以人类大肠癌细胞株LOVO细胞为研究对象，将ΔNp73基因用脂质体法转染LOVO细胞，进行细胞生长曲线和流式细胞术分析，测定转染ΔNp73基因后的LOVO细胞的增殖能力与凋亡率；以Boyden 小室体外侵袭实验检测ΔNp73基因转染前后LOVO细胞侵袭力变化，并用Westernblot法检测VEGF蛋白的表达。结果 转染了ΔNp73基因后的LOVO细胞生长速度较未转染ΔNp73的LOVO细胞明显加快(P<0.01)，凋亡率降低；Boyden 小室体外侵袭实验显示LOVOΔNp73细胞穿膜数较空白对照组和LOVOpcDNA3组增多, 差异具有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组相比， LOVOΔNp73细胞中VEGF表达较未转染ΔNp73基因的细胞明显增高(P<0.01)。结论 ΔNp73过表达促进了大肠癌细胞的增殖和血管生成，增强了大肠癌的侵袭力。

    【关键词】  ΔNp73 大肠癌 侵袭性 凋亡 VEGF

    虽然近年来对大肠癌治疗的研究已经取得了很大进展，但始终不能改变其发病率和死亡率高的特点，对患者预后亦无明显改善。因此，本研究探讨ΔNp73基因的高表达对大肠癌细胞生物学行为的影响，为临床防治大肠癌提供较可靠的理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    LOVO细胞株及真核表达质粒pCDNA3ΔNp73均由第三军医大学大坪医院肿瘤科惠赠。RPMI1640培养基、小牛血清购自Hycolone公司。胰蛋白酶购自Sigma公司。millicell chamber购自Millipore公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、青霉素、链霉素均购自Gibco试剂公司。VEGF试剂盒购自R&D公司。

    1.2  LOVOΔNp73细胞株的建立

    以人类大肠癌细胞株LOVO细胞为研究对象，将构建于真核表达质粒pcDNA3ΔNp73基因用脂质体法转染LOVO细胞，用G418沉筛选出过表达ΔNp73基因的细胞株，命名为LOVOΔNp73细胞株；同时以空载体pcDNA3转染细胞，命名为LOVOpcDNA3。

    1.3  台盼兰活细胞记数测定细胞的增殖能力与细胞活力

    胰酶消化收获细胞（含悬浮及贴壁细胞）制备单细胞悬液，以冷PBS悬浮，细胞浓度为1×105/ml。取9滴细胞悬液移入小试管内，加1滴0.4%台盼兰工作液，混匀，在3min内用血球记数板分别记数活细胞和死细胞。

    1.4  细胞增殖曲线MTT测定

    取对数生长期细胞悬液200μl/孔（含2×103个细胞）接种至96孔板，于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱，每组每天取3个复孔，每孔加入20μlMTT（5g/L）培养4h后弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μl，振荡10min溶解结晶紫。酶联免疫检测仪测定490nm波长各孔光吸收值（A490值）。

    1.5  流式细胞仪检测细胞凋亡

    将LOVO细胞制备成单细胞悬液，收集到5ml离心管中，离心，2 000g，5min，室温，冷PBS洗涤2次，离心，2 000g，5min，弃上清。再以冷PBS悬浮，细胞浓度为1×106ml。加5ml Annexin VFITC溶液和2.5μl PI到100μl细胞悬液中，混匀后室温避光反应30min。加入反应缓冲液400μl，流式细胞术对凋亡细胞进行定量检测。

    1.6  Boyden小室体外侵袭实验

    用改良的Boyden小室法[1]：用人工基质覆盖millicell chamber滤膜上的微孔，向小室内加入1×105/ml的细胞悬液, 培养 12h 后取出滤膜, 将下室面的细胞刮下，将膜固定，结晶紫染色细胞，高倍镜下随机取5个视野,计数细胞,取平均值。

    1.7  Westernblot检测VEGF蛋白表达

    按照RIPA蛋白提取步骤提取细胞总蛋白,采用Bradford法测定总蛋白浓度。取总蛋白40μg行SDSPAGE,电泳结束后电转印17h至PVDF膜,膜封闭液内封闭室温1h,4℃过夜,PBS洗膜5min×4,加入兔抗人VEGF单克隆抗体(1∶350),37℃孵育1h,PBS洗膜5min×4,再加入羊抗兔IgG(1∶2 000),37℃孵育1h,PBS洗膜5min×4,化学发光试剂与PVDF膜共同孵育1min,将PVDF膜与X光片共同放暗盒曝光4min,显影3min,定影10min。以GelPROANALYZER凝胶定量分析软件分析Westernblot检测结果,得出各条带的灰度值,以平均灰度值代表VEGF蛋白表达水平。

    1.8  统计学方法

    数据结果以±s表示,采用t检验, SPSS10.0统计学软件进行分析。

    2  结果

    2.1  台盼兰拒染实验

    台盼兰拒染实验中活细胞不染色，而死细胞染蓝色。结果显示ΔNp73转染后LOVO细胞的死细胞比例为（4.6+1.1）%,较LOVOpcDNA3组（7.5+0.8）％明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。

    2.2  MTT法测定细胞生长曲线

    MTT结果显示，转染ΔNp73的LOVO细胞较转染空载体pcDNA3的LOVO细胞组和空白对照组细胞生长明显增快，差异有统计学意义（P<0.01），见图1。

    图1  MTT法测定细胞生长曲线

    2.3  基因转染对大肠癌细胞凋亡率的影响

    FITCPI流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示转染空载体pcDNA3的LOVO细胞组凋亡率为（5.8＋1.2）％，而转染ΔNp73的LOVO细胞组的凋亡率为（2.4＋0.8）％，与LOVO/pcDNA3组对比凋亡率明显降低（P<0.01），见图2。

    图2  ΔNp73转染对LOVO细胞凋亡的影响

    2.4  Boyden 小室体外侵袭实验

    LOVO、LOVOpcDNA3 和 LOVOΔNp73细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为（21.4±0.1）、（22.8±0.4） 和（39.5±0.6）, LOVOΔNp73 细胞与LOVO 细胞和 LOVOpcDNA3细胞比较, 穿膜数量明显增加, 两者间差异具有统计学意义(P<0.01) 。而LOVO细胞和 LOVOpcDNA3细胞穿膜数的差异无统计学意义(P>0.05) 。

    2.5  VEGF蛋白表达Westernblot检测结果

    VEGF蛋白表达Westernblot检测结果见图3。转染pcDNA3后LOVO细胞中VEGF蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而转染ΔNp73能使VEGF蛋白表达水平升高,灰度值上升，与未转染p73基因的细胞相比上升了44.2％，差异有统计学意义 (P<0.05)，见表2。表2  转染ΔNp73前后LOVO细胞中VEGF蛋白含量

    3  讨论

    研究表明ΔNp73因为N末端转录活化区缺失导致转录活化功能完全丧失,对p53和全长型p73的转录活化和促凋亡活性有明显的负调节作用[2,3], ΔNp73除与大肠癌的发生、发展关系密切外，对神经母细胞瘤也是一个预示较差预后的分子标志[4]。但在某些肿瘤中，如甲状腺肿瘤，ΔNp73却有着抑制增殖的作用[5,6]。由于ΔNp73基因在不同的肿瘤中对细胞凋亡和血管生成的影响不同，因此本实验以ΔNp73基因在对大肠癌细胞的生长、凋亡率、体外侵袭性以及对血管调节因子的表达调节作为主要切入点进行了研究。

    本实验采用台盼兰拒染、MTT测定对转染后细胞的体外生长情况进行了分析。台盼兰拒染、MTT测定均可反映细胞的增殖情况，但作用的机制与侧重点不同。台盼兰是一种有机染料，当细胞损伤或死亡时，可透过细胞膜与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞阻止其进入，借此可鉴别活细胞和死细胞。本实验用该方法测定细胞的总数与存活率。MTT是一种淡黄色的化合物，它参与活细胞线粒体的能量代谢。在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将MTT还原成难溶性的紫兰色结晶物Formazan并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。在一定的细胞范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。DMSO能溶解细胞中蓝紫色的结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可以间接反映活细胞数量。我们认为，台盼兰拒染实验操作简单，方便快捷，但结果受人为因素影响较多。MTT法较客观准确，是一种较好的判断细胞增殖的指标，而Boyden 小室体外侵袭实验，则为检测大肠癌细胞转染ΔNp73基因后的侵袭力改变提供了直接证据。本实验将3种实验方法的结果相结合分析更具准确性和说服力。进一步流式细胞分析提示ΔNp73基因转染LOVO后细胞凋亡比例明显减少。这一结果提示ΔNp73基因过表达可以促进大肠癌细胞的恶性增殖，其可能的机制是ΔNp73的过表达通过影响p73的反式激活而导致其启动子活性的减弱,抑制p73诱导的凋亡[2]。

    除了上述指标，目前，对大肠癌的细胞生物学行为的研究中还有一个研究热点就是肿瘤血管生成 [7]。VEGF是迄今鉴定出来的最重要的促血管生成因子之一,VEGF能特异地与血管内皮细胞上VEGF受体结合,刺激内皮细胞增殖并促进血管形成。因此,VEGF是反映大肠癌细胞生物学行为的良好指标。在本研究中, 采用Westernblot法检测高表达ΔNp73的细胞中的VEGF蛋白表达水平,发现过表达ΔNp73大肠癌细胞株中VEGF蛋白的表达较对照组明显增高,表明ΔNp73的高表达打破了血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡,从而促进了血管生成。其可能的机制是当大肠癌发生时,抑制因子表达下调、刺激因子上调,并伴随着癌基因激活和抑癌基因失活从而促使病理性血管生成[8,9]。本实验结果提示ΔNp73的高表达能促进大肠癌血管生成，增强了其侵袭和转移的能力，这也给我们今后对大肠癌临床治疗研究提出了一个思路和课题：有效的抑制ΔNp73的过度表达，可以在基因水平上抑制大肠癌血管的生成，从而对癌肿的生长和侵袭起到有效的抑制作用。

    综上所述，ΔNp73以高表达的方式参与大肠癌的发生发展，抑制大肠癌细胞凋亡，上调血管生成因子VEGF的表达，促进了大肠癌血管增生，增强了大肠癌细胞的侵袭性。鉴于ΔNp73基因对大肠癌细胞的这些影响,我们认为，对ΔNp73进行检测，有利于从基因水平了解大肠癌的发生机制和生物学行为，从而对大肠癌作前瞻性估计，为临床上对大肠癌的诊断、鉴别诊断、治疗及预后判断提供重要的参考指标，同时，还可将ΔNp73作为新的肿瘤治疗靶点进一步深入研究。

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