乳腺癌易感基因BRCA1在DNA损伤修复中的肿瘤抑制作用

作者：李萍

    【关键词】  BRCA11 肿瘤 DNA双链断裂（DNA DSB 同源重组 非同源末端连接

    在生物的整个生命周期中都存在DNA损伤。这些损伤有由外源因素引起的，如电离辐射（ionizing radiation, IR）、紫外线（ultraviolet, UV）及化疗药物等，也有由内在因素引起的，如配子发生中DNA复制和减数分裂重组时的错误。研究认为在人类细胞中有六种主要的DNA损伤修复途径，分别是同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）、核苷剪切修复(nucleotide excision repair，NER)、非同源末端连接(nonhomologous endjoining，NHEJ)、碱基剪切修复(base excision repair，BER)、错配修复(mismatch repari，MMR)和Fanconi贫血途径。目前已经鉴定到100多种基因与这六种DNA损伤修复途径相关[1]。1994年，科学家用定位克隆技术成功地克隆了第一个与家族性乳腺癌和卵巢癌相关的基因BRCA1 (breast cancer susceptibility gene 1)[2]。BRCA1的生殖系突变使妇女易罹患乳腺癌和卵巢癌。BRCA1包含24个外显子，人类编码的该蛋白包含1863个氨基酸残基，而小鼠编码的为1812个氨基酸残基。自BRCA1发现以来，越来越多的研究表明该蛋白在HRR、NHEJ、NER和Fanconi贫血等DNA损伤修复途径中具有重要作用。因此，本文就近年来BRCA1在DNA损伤修复以及肿瘤抑制中的作用机制进行了综述。

    1  BRCA1缺陷与乳腺肿瘤

    BRCA1是一个确定的肿瘤抑制基因，它的生殖系突变容易使妇女患上乳腺癌和卵巢癌。BRCA1乳腺癌小鼠模型的建立有助于肿瘤发生机制、肿瘤预防及治疗的研究。大多数BRCA1突变系在怀孕期间死亡，因此只有那些携带组织特异或亚等位基因突变的个体可以长成成体[36]。

    在条件性阻断小鼠乳腺BRCA1基因的研究中，Xu等[7]发现乳腺肿瘤在长期潜伏后发生频率较低。大多数肿瘤的p53转录也发生了改变，暗示了这个肿瘤抑制因子在BRCA1相关的肿瘤形成中的作用。研究发现，虽然p53+/-突变的引入能显著加速肿瘤发生，但乳腺肿瘤还是以随机形式出现，表明除p53之外还有多个因子涉及此过程。乳腺肿瘤中高度不同的组织病理学类型也支持该结论[4，6]。同时，表达研究也揭示了遗传或分子的大量改变，即erbB2、cMyc、p27和Cyclin D1在大多数肿瘤中的过表达[6]。从Brca1条件阻断小鼠中得到的肿瘤显示出高度的染色体异常，这恰恰是癌细胞的主要特点之一。通过增加造成恶性表型的特定突变可促进癌症的发生。在大多病例中的染色体异常反映出有丝分裂功能减弱，包括染色体的不均等分布和细胞浆无法移动，导致非整倍性细胞形成。这和Brca1突变体小鼠肿瘤是在基因组不稳定之后发生的观点相一致。

    2  BRCA1和DNA双链断裂(DSB)修复

    目前的研究表明BRCA1在细胞的DNA 损伤应答中扮演重要角色，能够介导损伤的感受器及修复的效应器。细胞经DNA损伤因子处理产生DSB后，BRCA1能够超磷酸化并被迅速地重新定位，其新位点在增殖细胞核抗原标记过的复制叉上[7]。此外，在一个大的细胞核蛋白复合物中也发现了BRCA1，被命名为BRCA1相关监测复合物（BRCA1associated surveillance complex, BASC），该复合物被认为在监控基因组损伤和下游蛋白信号传递中具有传感作用[8]。

    DSB修复的主要类型有两种：HRR和NHEJ。HRR是典型的无错修复，由一个非损伤同源序列通过基因转换来修复损伤的双链。NHEJ通常与断裂点序列的变化有关。序列修饰的程度从损失或获得一两个碱基到大范围的删除有很大不同。这一途径的诱变潜能更多是由修复的质量来决定的，而非断裂点是否重新连接。如果断裂点有序列缺失，由此而诱导的连接通常是由一个大小为8碱基的微同源区域介导。HRR偶尔也能在序列中通过交换引入错误，但是交换产物在哺乳动物细胞的有丝分裂中被迅速地抑制了。

    3  BRCA1和同源重组修复(HRR)

    在哺乳动物细胞中HR有两种可能的作用：一种是修复DNA DSB，另一种是在无法通过特定的聚合酶进行复制叉反转及跨损伤修复时，重启由单链损伤造成的复制叉停滞。虽然最初认为BRCA1对基因组的保护可能是通过控制细胞周期间接实现的[9]，但是细胞周期产生修复缺陷的遗传解离使得这一想法变得不可能。BRCA1在对DSB的响应中具有直接作用，能募集BRCA2，进而促进Rad51蛋白丝状体的形成[10]。Rad51是一种DNA重组酶，与细菌RecA蛋白同源，该酶参与有丝分裂和减数分裂中同源重组和DNA双链断裂修复，并且能与BRCA1共定位，因而是同源重组所必需的。BRCA1是Rad51的亚核装配所必需的，并且也是用DNA交联剂顺铂处理细胞后仍能使细胞存活所必需的[18]。BRCA2Rad51和BRCA2BRCA1蛋白的直接相互作用已经有报道，不过，Rad51和BRCA1很可能是间接通过BRCA2在DNA损伤位点实现关联的。

    BRCA1与另一DNA损伤响应蛋白Rad50也有联系，Rad50能与Mre11以及Nijmegen破损综合征基因1蛋白形成一个紧密复合物。Mre11/Rad50/Nijmegen破损综合征基因1(MRN)复合物与同源重组和NHEJ相关。Mre11或Rad50的蛋白聚合物会被募集到DSB位点，但Rad51聚合物在相同细胞及相同时间却从未观察到[11]。Rad50和Rad51能够在DNA损伤后共定位于磷酸化的H2AX(γH2AX）聚合物上[12]。BRCA1也能同γH2AX共定位并在Rad50或Rad51之前募集到这些位点，这表明BRCA1能决定Rad50或Rad51的募集。不过，MRN也能在H2AX存在或缺乏的条件下及早募集到DSB位点。因此可以推测，BRCA1与DSB或复制叉延迟的响应有关，并能控制后续的修复蛋白MRN或BRCA2/Rad51的募集。目前就MRN复合物是否与人类细胞中的同源重组有关还不清楚，但是推测MRN复合物可能在解决复制叉延迟方面起作用，并且也有报道Nijmegen[13]破损综合征基因1蛋白在DT40细胞中能促进同源重组。Nijmegen破损综合征基因1的破坏能导致基因转变及姐妹染色单体交换能力减弱，但是γ辐射（6Gy）诱导的Rad51聚合物的形成却没有受到影响。因此， BRCA1是如何在募集BRCA2和Rad51的同时又影响MRN复合物尚待研究。Zhang[14]等的研究表明在同源重组后，BRCA1功能缺失能产生更多Mre11聚合物，并且BRCA1的补充能抑制Mre11聚合物形成。

    在Bloom综合征中缺陷的BLM解旋酶在延迟复制叉和阻止过多数量的同源重组中具有功能。BLM能从生物化学角度，反转Holliday连接的形成。当BLM缺失时，姐妹染色单体交换更加频繁，表明BLM正在阻止Rad51介导的重组。虽然BLM功能和BRCA1之间的关系还没有被完全阐明，但是BLM和BRCA1解决复制叉延迟的两种不同途径已成为一个模型。复制叉延迟能导致“鸡爪”结构（复制叉反转，也就是新合成的链退火相互间形成一个四链结构）的形成[15]。BLM是具有特异活性的逆转“鸡爪”结构的解旋酶。因此，阻止复制叉前进的损伤能被复制叉反转或模板转化避开，然后BLM通过反转复制叉结构在重启复制中起作用。延迟的复制叉也能被特定的核酸内切酶（如Mus81）切割，形成一个双链DNA末端，从而起始一个链交换反应。可以假定BRCA1促进延迟复制叉向切割结构的转化，从而起始Rad51依赖的链交换。但是这些过程的精确细节仍未阐明，在这个模型中BRCA1和BLM被期望出现在损伤监测复合物中，并且BLM被认为是BRCA1相关监测复合物的一部分。另外，与BRCA1相同，在电离辐射后BLM通过ATM磷酸化并和Rad51形成聚合物。

    4  BRCA1和非同源末端连接(NHEJ)

    与NHEJ相关的基因型多态性与高风险性的乳腺癌有关[16]。BRCA1能够影响患乳腺癌的风险和DNA DSB 末端连接能力，这一结果表明NHEJ与BRCA1相关的乳腺癌发生有关。不过，关于BRCA1在NHEJ中功能的报道却有一些矛盾的结果，这些结果所反映的可能是测量NHEJ的不同方法以及NHEJ有不同亚路径。

    NHEJ亚型存在于哺乳动物细胞中，包括无误差及易错末端连接。无误差末端连接是通过用细胞提取物或细胞介导的在体外使线性化质粒恢复为圆形DNA时的重连接实验检测到的。大多数物理性末端连接是易错的，如V(D)J重排的编码连接。当依赖Ku的修复路径中一个或多个组分缺陷时，序列会出现或大或小的变化（如删除）。近来，有证据表明无误差和易错末端连接有不同的遗传需要[17]，存在不止一种NHEJ路径。目前的研究支持BRCA1是NHEJ的无误差形式所必需的，但是与NHEJ调节相关的机制还不清楚。

    从酵母和哺乳动物细胞得到的证据都强烈支持不依赖Ku的NHEJ是一个易错步骤[18]。BRCA1也可以调节易错末端连接：BRCA1失活与DSB位点的大序列删除有关。BRCA1和人类Rad50之间的物理性作用已经观测到了，但是这种相互作用的功能性结果还不清楚。最近，Hopfner等[19]通过晶检仪得到的证据显示Rad50在其螺旋区形成一个吊钩状结构。这样，与两个Mre11蛋白DNA结合域相互作用的RAD50蛋白的球状头部就能够通过这个吊钩状结构，将两个独立的MRN复合物连接起来，进而将两个DNA末端联系起来。这一机制可使姐妹染色体连接在一起以进行同源重组或使不相干的断裂末端连接在一起以促进NHEJ。因此，MRN复合物能同时发挥结构支持功能及和Mre11相关的核酸酶功能。Wang[14]等的研究表明BRCA1能抑制MRN复合物，从而减少了相关的易错NHEJ。另外，他们也观察到BRCA1缺陷的细胞倾向于用微同源性来介导末端连接，这与已报道的酵母Mre11的作用相似。BRCA1在体外抑制Mre11的溶核活性的生化结果支持了野生型BRCA1能抑制Mre11活性从而阻止易错末端连接的假设。WRN和Artemis等核酸酶在末端连接中具有潜在的功能，因而很有可能存在一种不同于Mre11的未知蛋白，这种蛋白可能受到BRCA1的抑制。

    5  BRCA1和Fanconi贫血蛋白之间的功能关系

    研究表明FANCD2蛋白的单泛素化是Fanconi贫血路径的关键步骤，并且依赖于BRCA1的功能。BRCA1缺陷的细胞与DNA损伤诱导的FANCD2亚核聚合物缺失及FANCD2的单泛素化相关。几种证据显示FANCD2可能是BRCA1 E3 泛素化连接酶活性的一个靶点，但是这些研究都没有指出FANCD2是BRCA1/BARD1泛素连接酶的直接底物。相反，最近的研究发现小干涉RNA介导的人细胞BRCA1敲除能导致FANCD2对DNA损伤位点的靶向缺陷，而非FANCD2泛素化缺陷。与之相似，BRCA1和BARD1均被敲除的突变体DT40细胞对DNA损伤很敏感，但该细胞在FANCD2泛素化中没有缺陷。因此，BRCA1介导的泛素化的目的，靶蛋白以及这种泛素连接酶活性对BRCA1在同源重组或肿瘤抑制中的作用是否重要仍然是未知的。近来的报道显示BRCA1相关的解旋酶BACH1在同源重组有一定的作用，并且似乎是Fanconi贫血基因产物FANCJ。BACH1被当作FANCJ及FANCD1被当作BRCA2的结果表明在BRCA1和Fanconi贫血途径之间存在多种联系[20]。

    6  BRCA1和核苷剪切修复(NER)

    NER分为两种途径：全基因组修复（GCR），能将损伤从整个基因组除去；转录偶联修复（TCR），能优先从表达基因的转录链将损伤除去。Gowen等的研究表明，BRCA1缺陷的小鼠ES细胞无法执行DNA氧化损伤修复，并且对电离辐射和过氧化氢具有超敏感性。这些结果显示BRCA1直接或间接地参与了DNA氧化损伤的TCR。

    近来，Hartman和Ford研究了两种人U2OS骨肉瘤细胞系UBR60和E621[21]。UBR60携带野生型p53，E621来源于UBR60。由于人乳突淋巴瘤E6的稳定表达使得p53缺失（因为E6是以p53为降解对象的）。这两种细胞系都表达低水平的内源BRCA1，外源转染的BRCA1是由四环素调节控制的。这些细胞是研究BRCA1和p53对NER作用的模型。他们的研究显示，四环素存在的条件下，p53缺陷细胞中GGR的效率比在p53野生型细胞中显著低。这一结果表明p53功能缺失导致GGR缺陷。BRCA1的表达能使p53缺陷的E621细胞的GGR恢复，在24小时内，DNA修复从没有BRCA1诱导时的3%上升到34%。p53野生型细胞UBR细胞中BRCA1的诱导能使GGR的能力从28%上升到42%[21]。这些结果表明BRCA1在GGR中具有重要作用。

    紧接着，他们研究了BRCA1能否在这些细胞中影响UV辐射的TCR。用一个表达基因（DHFR）的单链特异性引物，发现BRCA1突变仅仅影响未转录链的修复，而不影响UV诱导的转录链。因此，虽然之前的研究表明BRCA1在DNA氧化损伤的TCR中有一定作用，但是并不影响UV辐射诱导的TCR。

    7  BRCA1磷酸化后的转录调节

    BRCA1已被鉴定为几种核磷脂酰肌醇3激酶相关物的靶点，如ATM和ATR。

    ATM可以使BRCA1的Ser1387、Ser1423、Ser1457和Ser1524在体内或体外磷酸化， ATR也能在体外使与ATM相同的Ser1423等6个丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化。近来发现，被认为是肿瘤抑制因子的蛋白激酶（Chk2）在电离辐射后能与BRCA1在离散的核聚合物中相互作用，并使BRCA1在Ser988位点磷酸化。不过，关于这些不同的磷酸化事件是怎样作用于功能修复路径的研究报道还很少。Zhang[22]等的研究显示，依赖Chk2的磷酸化位点Ser988是调节BRCA1在同源重组和非同源重组中功能的主要通道，该通道在Chk2和DSB修复的调节之间建立了一种联系。然而Chk2介导的BRCA1磷酸化随后是怎样调节DSB修复的目前还不清楚。生物化学研究表明BRCA1在第452到1079氨基酸处存在一个DNA结合域，该域使得BRCA1能够抑制Mre11的体外核酸外切酶活性[19]。与此同时，该研究还显示一个Rad51互作域被定位在第758到1064氨基酸的BRCA1片段上。在Zhang[22]等的研究中，BRCA1的Ser988位点不仅负责控制同源重组，还对抑制易错末端连接非常关键。因此，Ser988突变将会改变DNA结合域的功能。另外，该位点突变可以影响BRCA1和Rad51之间的相互作用，但是体内的直接证据还有待阐明。

    除了DNA修复，BRCA1介导的细胞周期检查点效应也能被蛋白激酶调节。S1423A突变能破坏BRCA1产生G2M期阻滞的能力，但仍保留了其DNA修复能力。相反，依赖ATM的电离辐射诱导的S期检查点需要的是BRCA1的Ser1387位点而非Ser1423位点。经验证，当姐妹染色单体可以作为模板时，同源重组在细胞周期的S和G2M期扮演重要的角色。但是维持S和G2～M细胞周期检查点的能力被认为是不依赖于同源重组的。BRCA1的S988A突变能阻碍其在同源重组中的作用，但是对S期检查点是没有影响的；相反，S1423/1524A突变具有正常的同源重组，但是G2～M期检查点缺陷。

    MDC1是另一个依赖于ATM的重要BRCA1磷酸化调节因子[23]。这个蛋白是具有NH2末端的FHA关联域和BRCT域串联重复的核因子。这些域在与DNA修复或DNA损伤响应路径相关的几个蛋白中都存在。MDC1是激活哺乳动物细胞DNA损伤响应蛋白Chk2所必需的。当MDC1在细胞中被负向调节时，电离辐射不能诱导BRCA1聚合物。因此，MDC1在依赖BRCA1的同源重组和细胞周期检查点中的作用仍需进一步研究。

    BRCA1位于DSB响应路径的关键交叉点上。磷酸化后的BRCA1转录调节在BRCA1和Chk2、ATR以及ATM之间建立了联系，并且为了解BRCA1与Mre11及Rad51的关系提供了线索。BRCA1突变，Chk2、ATR或ATM活性的改变能促进遗传不稳定性并增加乳腺癌和其它肿瘤的易感性。大量证据表明ATM突变能提高乳腺癌的易感性。流行病学研究已将Chk2和BRCA1列为同种乳腺癌发生路径。MRN复合物的遗传突变已经在乳腺癌中得到鉴定[24]。其它的可能性是ATR或Rad51缺陷可能与易患乳腺癌者的体质有关。

    8  BRCA1缺失的遗传不稳定性

    DNA损伤修复基因缺失后的一个直接后果是遗传不稳定性。Shen等[25]分析了从E8.59.5BRCA1缺失胚胎分离到的染色体，通过频谱染色体核型分析（spectral karyotyping，SKY），发现BRCA1缺失的胚胎在染色体数量和结构上都有异常。在BRCA1突变体MEFs、乳腺肿瘤和Brca1突变体小鼠的淋巴瘤中也发现了完整的染色体损伤。通过比较基因组杂交（comparative genome hybridization, CGH）和SKY对Brca1条件阻断小鼠中的乳腺肿瘤进行深入分析发现，Brca1缺失肿瘤表现出与人类乳腺癌相似的染色体获得和缺失[26]。大多数肿瘤（9/15）表现出末端染色体11的获得，而这一区域与人类染色体17q11qter类似，图谱位置erbB2。有四种肿瘤也显示出相同数量的近端染色体11缺失，近端染色体11与人类染色体17p类似。在八种肿瘤中观察到染色体15的全部或部分获得集中于15D2D3，类似于人类染色体8q24，即cMyc基因的图谱位置。六种肿瘤表现出染色体14的部分或全部缺失，包括14D3，即Rb1的图谱位置。这些观察表明在Brca1条件阻断小鼠的乳腺肿瘤中erbB2，cMyc和p53缺失的表达增加。

    Brca1突变体细胞也表现出异常的中心体扩大和G2M细胞周期检查点控制的缺失[27]。这些异常很可能是不依赖于DNA损伤并能促进遗传不稳定性。因此，Brca1突变体细胞中的遗传不稳定性可能是这些缺陷共同作用的结果。

    9  结束语

    BRCA1在DNA损伤修复和肿瘤发生中具有重要作用。BRCA1缺陷能削弱HRR, NHEJ, Fanconi贫血途径以及NER。DNA损伤修复缺陷和G2/M细胞周期检查点异常能共同引起BRCA1缺陷细胞的遗传不稳定性。DNA损伤积累能激活p53抑癌基因并诱导细胞周期阻滞和凋亡，从而引发一系列生理应答，包括细胞增殖缺陷，分化和转录调节缺陷。这些异常使BRCA1突变体产生胚胎致死。另一方面，BRCA1缺陷也能增加所有基因的突变率，包括p53。p53缺失或突变能使DNA损伤细胞存活下来，并经历克隆扩增，最终产生癌变。

    癌症发生是一个多步骤的过程。从BRCA1生殖系突变开始，乳腺癌发生所必需的其它遗传事件尚不清楚。例如，在90%以上的乳腺癌相关癌症中发现p53基因失活，但这一结果的原因在DNA修复方面的作用还不清楚。通常的解释是损伤诱导的凋亡缺失会使受损细胞得以存活进而促进突变。目前还不清楚为什么BRCA1突变会使个体仅仅罹患乳腺癌和卵巢癌，但是该研究方向在肿瘤发生机制的研究及女性健康的维护方面具有深远的意义。

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